细胞生物学具体研究方式.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 四、分子杂交技术 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 原位杂交（in situ hybridization）。 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 五．定量细胞化学分析技术 ?显微分光光度测定技术 ?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质，如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry） ?主要应用： ★用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特 异蛋白的含量； ★测定细胞群体中不同时相细胞的数量； ★从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； ★分离DNA含量不同的中期染色体。 流式分选仪 ＋2000V －2000V 高压偏转板 充以正电的小水滴 充以负电的小水滴 分别收集细胞 激光 排列成单列的细胞通过激光束时，仪器可测定出标记细胞上的荧光强度； 仪器使带有荧光细胞的小水滴充电； 带电水滴通过高压偏转板偏离原来方向，收集细胞； 未含标记的细胞或不含有细胞的水滴不偏转。 水滴充电信号 第三节 细胞培养、细胞工程技术与显微操作技术 一、细胞培养 细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。 体外培养细胞必须注意三个环节： 物质营养：由培养基提供。 物质营养、生存环境和废物的排除。 1、原代培养 原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。但一般通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 （一）动物细胞培养 2、细胞系和细胞株 原代培养经首次传代成功后即为细胞系 细胞系传至50代后，许多细胞不能再传下去，但有少部分细胞发生遗传突变，可在培养条件下无限制地传下去，这种传代细胞称为永生细胞系。 10代 原代培养 50代 传代培养 遗传物质不变，接触抑制 （细胞系） 传代培养 遗传物质发生变化，无接触抑制 3、 动物细胞培养方法 ◆贴壁培养 分散的细胞悬浮在培养瓶中很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态性，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养，单层培养的细胞保持接触抑制的特性。 ◆悬浮培养 悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长，如T细胞的培养就是如此。悬浮培养的条件较为复杂，难度也较大，但是容易同时获得大量的培养细胞。 （二）植物细胞培养 单倍体细胞培养：花药 原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁 原生质体 (三)非细胞体系 （DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡运输，细胞核装配等） 细胞提取物，细胞核提取物 二、 细胞工程 （一）细胞融合 细胞融合是指自发或人工诱导下，两个或多个细胞融合形成一个双核或多核细胞的现象。 自发的动物细胞融合几率很低，1962年Okada和Tadokoro发现灭活的仙台病毒有促进细胞融合的作用。 病毒外壳上的糖蛋白具有促进细胞融合的功能。 聚乙二醇也有促进细胞融合的功能。 （二） 单克隆抗体 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体 的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗 体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某 种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限 增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内 条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。 杂交瘤细胞产生 单克隆抗体示意图 取出制造该抗原特异的抗体的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 混合并进行细胞融