质谱法测定分子结构二大分子.pptVIP

* Organic Detergent Salt Water pH Urea CHAPS Imidazol 洗脱条件 Wash Conditions 芯片表面类型 Surface Type 飞行质谱检测Measured m/z 2500 5000 7500 10000 0 20 40 60 5807.5 化学表面芯片的蛋白质剖析：三维分离 * 血清白蛋白的分离鉴定 pH4.5 pH5.5 pH8.5 Albumin Transferrin 血清白蛋白 pI ~ 5.5 pH 4.5 + 净电荷 pH 5.5 no 净电荷 pH 8.5 - 净电荷 Transferrin铁传递蛋白 pI ~ 6.5 pH 4.5 + 净电荷 pH 5.5 + 净电荷 pH 8.5 - 净电荷 Transferrin * Detector N-Laser TOF-MS Trace View Gel View Map View 蛋白指纹图谱仪－芯片阅读器 电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定质量 分析范围广，敏感性高 * Difference map Patient Control GelViewTM 蛋白指纹图谱的发现 * 仪器 鉴定率 肽质量指纹谱 MALDI ~50% (Peptide Mass Fingerprinter, PMF ) 多肽序列标签 LC/MS/MS ~80% (Peptide Sequence Tag, PST) 从新测序 LC/MS/MS 80% (De Novo) 蛋白质及混合物的定量分析： 同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags, ICAT) 蛋白质序列研究的三个层次 * 蛋白质组研究技术路线 样品(组织、细胞等) 凝胶图象分析 蛋白质鉴定 二维数据库 酶解 HPLC-MS、MS/MS 数据库检索 二维凝胶电泳 酶解 肽混合物 MS、MS/MS 肽指纹谱 肽序列标签 从新测序 * 一、肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinter, PMF) PMF测定速度快。 PMF灵敏。 PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。 * 分离的酶解的蛋白质 96/384位样品靶 数据处理和数据库检索 质谱样品的准备 MALDI质谱分析 蛋白质一级结构结果 PMF方法的一般流程 * 洗胶/去污 脱水 减少S-S键 洗涤/脱水 1、In-gel 酶切/消化 Multiprobe (4x96 Well Plat) 样品体积0.5-100 ?L 板上加热和冷却 消化板加热 37oC 肽存储在-4oC冷却板 酶试剂存储在-4oC冷却板 修正-SH基 加入trypsin溶液 5-12小时 肽提取 2、质谱分析样品的制备 灵敏度： 500fmoles BSA in-gel。 移液和消化时间8小时(1x96 well plat)。 最多可进行4x96 well plat的同时消化。 基本能力 * 3、质谱测定 设这检索的条件，不同软件有不同的参数和用法。 MALDI-TOF 质谱测定 4、数据库检索 parmeters 参数的选择 样品-1 样品-2 样品-3 Program used MS-Fit PeptIdent PeptIdent pI range NO 3~7 3.7~7.7 Protein mass range 20~50kD 15~45kD 15~45kD Specie searched MAMMALS MAMMALS MAMMALS Digest used Trypsin Trypsin Trypsin Peptide mass accuracy ±2Da ±0.5Da ±0.5Da Methionice is Oxidized Oxidized Oxidized Cysteine is Carbamidomethylation(Cys-CAM) Pepptide masses are Average Monoisotopic Monoisotopic Mumber of peptides 5 5 5 Number of missed cleavages 1 1 1 Number of peptide used in search 11 17 15 * 样品1 样品2 样品3 数据库检索结果： 带*号的峰为与数据库中的峰相匹配的峰。 样品1：甘油醛-3-磷酸脱氢酶 样品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶 样品