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多肽链断裂成多个肽段 可采用两种或多种不同的断裂方法(如酶解、化学断裂等）将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 测定每个肽段的氨基酸顺序 肽段的的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法。 一级结构分析的经典三步曲 蛋白质一级结构测定的步骤 1、蛋白质的分离纯化 Purification 2、二硫键的拆分与保护 S-S cleavage blocking 3、(亚基分离） Subunit separation 4、多种方法的部分水解 Partial hydrolysis 5、分离水解后得到的多肽 Peptide separation 6、测序 Sequencing 7、重叠 Overlapping 8、二硫键位置的确定 Disulfide bond po. Cys 容易引起的问题 1、Cys受空气氧化而形成Cys-Cys 2、Cys和Cys-Cys会发生交换反应 3、分析氨基酸组成时，Cys容易受修饰而 不利于定量 4、S-S键使蛋白酶