大提质粒步骤完整版.docVIP

大提质粒步骤 试剂配制： 1. 1M NaOH (400ml )：分子量为40，秤取16g NaOH，溶于400ml DDW中。 2. 2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml DDW中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。 3. Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml DDW，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。 4. Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml DDW，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。(注：不需要定容，严格按步骤操作。) 5. Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml DDW中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。 6. Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MoPS 10.46g，加入600ml DDW，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。 7. Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MoPS 10.46g，加入600ml DDW，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。 8. Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml DDW，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。 9. 10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800mlDDW，均匀混合后定容至1L。 10. 配制RNase： (1) 将RNase粉末溶于10mM的乙酸钾（即Buffer P3），配制成浓度为10mg/ml的溶液。 (2) 将配好的RNase溶液100℃加热10min, 随后冷却至室温。 (3) 用1M 的Tris-HCl调节pH值至7.4，大约需要0.1体积的Tris-HCl。 (4) 分装RNase溶液于1.5ml EP管中，-20℃保存。 使用前注意事项： 在提low-copy（低拷贝）质粒时，增加lysis buffer（裂解液）体积可以提高碱性裂解的效率以及DNA的产量。 Buffer P1在使用前加RNase A solution（RNA酶溶液），一瓶Buffer P1加入一小瓶RNase A（用前瞬时离心），终浓度为100ug/ml。 检测Buffer P2是否有因低温储存而引起的SDS沉淀。如有必要，将SDS在37℃溶解。 Buffer P3在4℃下预冷。 在选择平板上挑选一个单克隆，在相应抗性的LB2—5ml中进行初培养：37℃摇床300rpm下初培养约8h。 （使用的管子或烧瓶至少是培养体积的4倍。） 2、将初培养菌液用选择性LB培养基稀释到1/500到1/1000。High-copy plasmid（高拷贝质粒）：用100-200ul初培养液接种100ml介质。Low-copy plasmid（低拷贝质粒）：用250-500ul初培养液接种500ml。37℃摇床300rpm下初培养约12-16h。OD600?=4-5，此时培养细胞浓度可达到约3-4×109个/ml。 (使用的烧瓶或容器至少是培养体积的4倍。） 3、4℃离心机6000g离心15min收集细菌细胞。 （如果想在此步骤停止以后再做，把细胞-20℃冻存。） 10mlBuffer P1重悬细菌细胞。 （确保Buffer P1里已经加入RNase A。为使细菌完全重悬，用振荡器充分溶解菌液沉淀。） 加入10mlBuffer P2，轻轻上下颠倒封盖的管子4-6次彻底混合溶液，室温（15-25℃）下放置5min。 （不要斡旋，因为斡旋能导致基因组DNA被剪断。裂解液会有粘性。溶解反应不要超过5min。装有Buffer P2的瓶子用后要立即盖紧，以免被空气中的CO2酸化。） 加10ml预冷的Buffer P3，立即轻轻上下颠倒4-6次混匀，冰上放置20min。 （预冷的Buffer P3和冰上放置能促进沉淀。加入Buffer P3后有乳白色的物质形成且裂解液粘性减少。沉淀物中含有基因组DNA、蛋白质、细胞残渣。） 20 min后，6000 g 4℃离心25min。同时，向柱子中加入10ml Buffer QBT，使其全部流过柱子，平衡柱子。 剪一小块纱布，折叠4层，放