大肠杆菌功能启动子筛选过程.docVIP

大肠杆菌功能启动子筛选过程 强启动子对于基因工程操作中外源基因的表达效率有显著的影响，因此他的筛选具有重要的意义。 大肠杆菌的启动子位于-10区和-35区，常见的原核生物在启动子上虽然没有较大差别，但是为了能高效表达，还是应从大肠杆菌自身的基因组中选择强启动子，因为这也和外源启动子稳定性和大肠杆菌RNA聚合酶结合的倾向性有感（优先结合与自身）；另外还要考虑载体的拷贝数，多拷贝载体和单拷贝在形成产物的量上是有差别的，当然，如果能够通过载体把外源基因整合到宿主（这里指大肠）上，这样就能防止在传代是质粒不稳定或丢失的现象。 筛选步骤： （1）大肠杆菌基因的分离：去垢剂溶解细胞，酚和蛋白酶去除蛋白质，核糖核酸酶去除RNA，乙醇沉淀等步骤，得到大肠杆菌基因组、 （2）DNA分子的切割：用限制性核酸内切酶进行切割；限制酶产生的黏性末端、末端转移酶合成的同聚物接尾以及合成的人工接头等。酶切后的片段中就含有想要得到的启动子片段，片段进行PCR扩增。 （3）载体选择：能在大肠杆菌中自主复制，对某些限制酶来说只有一个切口，并在酶作用后不影响其自主繁殖能力。从细菌核酸中易于分离和纯化。在宿主中能以多拷贝形式存在，有利于插入的外源基因表达，能在宿主中稳定地遗传。进入宿主细胞的载体主要有：a质粒：重组DNA以转化的方式进入宿主细胞；bλ噬菌体：重组DNA以转染的方式进入宿主细胞；c柯斯质粒：以转导的方式进入宿主细胞。我们这里选择以来自大肠杆菌的含有氨苄青霉素抗性基因的不含启动子的PBR322质粒作为载体（常用的质粒载体，能在基因公司很容易买到因为题目要求要以氨苄青霉素抗性基因作为报告基因）。酶切质粒（选与2中一样的酶来切，这样就能得到相同的粘性末端，容易将质粒与DNA片段结合），PCR扩增至一定量。 （4）质粒片段与DNA片段结合，导入受体细胞（这里是大肠）。 （5）将得到的大肠杆菌在液体培养基中进行培养。 （6）制作青霉素梯度平板或者是添加有青霉素的梯度ＬＢ液体培养基。 （7）将5中得到的菌体稀释为菌悬液，在6中涂布培养或液体发酵培养。 （8）含有强启动子菌体的检出。因为能在青霉素中生长大肠是经过了质粒导入后的氨苄青霉素抗性基因的表达引起的（当然，也有一些是野生型大肠杆菌发生了突变，所以在选择报告基因时我们更应倾向于选择双报告基因作为标记），而他的表达则证明了启动子的存在。（大多数情况下，在高浓度青霉素环境中生长的都是成功导入质粒载体的菌体，且能在越高浓度青霉素环境生长的为能高效表达的，即含有强启动子的基因） （9）将8中检出的菌体在一定量青霉素培养中培养，扩大培养，淘汰不能稳定遗传的菌体，破壁，收集质粒。收集到的质粒继续以同一种酶切割。 （10）切割后得到的片段以探针（大肠杆菌-30区和-10区启动子为CAAT和TATA，探针就是由他们的互补链在固定相上做成，可以买的）吸附，富集，得到大肠杆菌的强启动子。