染色体自主复制序列的.pptVIP

* * 第三节 染色体自主复制序列的 分离与鉴定 一．分离ARS的一般程序 染色体DNA→限制酶切→与整合型载体连接→转化相应的宿主细胞→分离纯化转化体*→分离各转化子总DNA→转化E.coli→药物抗性菌落→分离质粒DNA→重新转入宿主细胞→高频重组转化体 *在获得第一次转化体后，可利用下述方法淘汰掉全部因整合作用所形成的转化体： ? 转化体菌落→点种在合成和完全培养基上的同一位置→培养→将完全培养基平板上的菌落影印到另一个合成培养基平板上→培养→比较两个合成培养基平板上生长的菌落，挑选那些在第二个合成培养基平板上不生长的相应位置上的菌落（从第一个平板上挑取） 二．ARS的分析与鉴定 1．限制酶谱与次克隆 2. 倒位分析 3. 插入分析：将1.4Kb EcoRI片段分离出来，插入另一个整合载体，其重组DNA分子的转化频率可大大提高 4. 定位分析 5. 遗传稳定性分析 6. DNA序列分析 用ARS DNA作探针与染色体DNA杂交，只能有一杂交带出现，这表明各ARS顺序之间不能发生交叉杂交，但不同的ARS显然只能利用同种DNA聚合酶。 核苷酸顺序测定结果表明，来自不同的ARS顺序含有11个核苷酸的保守序列： A(T) TTTATA(G)TTTA(T) AT含量几乎