第二章 基因工程基础(2).pptVIP

第二章基因工程基础（2） 2.1.2 基因的分离 基因的分离是基因工程研究中的最重要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。 每个基因特别是单拷贝基因只占整个基因组的很小一部分，且化学结构相似，均由A、T、G、C四种碱基组成，具有极其相似的理化性质，给特定基因的分离带来很大的困难。 早期曾利用DNA链中富GC区的解链温度(Tm)高于富AT区的特点，通过加热解开部分双链，再用单链核酸酶S1切掉单链，得到富GC区的片段。这种方法现在已经不用。 2.1.2.1 鸟枪(shot gun)法 又叫霰弹法，是用生化方法如用限制酶切割基因组DNA，得到许多长度与一般基因大小相当(0.8～9?106Da)的片段。然后将这些片段的混合物随机地重组入适当的载体，转化后在宿主菌中扩增，在用适当的方法筛选所需的基因。 本法要求有简便的筛选方法，如利用基因(营养)缺陷型宿主菌、特异的寡核苷酸或DNA片段探针、特定基因产物的抗体等，通过表型筛选、分子杂交或免疫结合等技术检出目的基因。 鸟枪法常用于建立基因文库和原核生物基因的克隆。 建立基因组文库 基因组文库是指将基因组DNA经限制酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段，随机地与相应的载体进行重组、克隆，所得的克隆群体即组成基因组文库，它代表了该基因组的所有序列。 为从基因组文库中筛得所需基因而要求的重组体数目的大小可用下式计算： N = ln(1-p)/ln(1-f) 式中p为期望概率，f为单个重组体中的插入片段在基因组中所占的份额比，N为所需的重组体数。 如欲在一哺乳动物基因组(3?109 bp)的17kb片段的文库中，使含有一给定DNA序列达99%的概率，计算得N为8.1?105。即：基因组DNA部分酶解片段大小为17kb时，所建基因组文库至少应含有8.1?105以上重组体，才能代表整个基因组。酶解片段越大，所需重组体数越少。 组建基因组文库用的载体 ?噬菌体 黏(质)粒 人工染色体： 酵母：YAC 细菌：BAC 噬菌体：PAC 哺乳动物：MAC 2.1.2.2 cDNA法（即逆转录法） 由于真核生物的基因中常含有非编码间隔区（内含子），在原核受体中无法正常表达，必须设法消去内含子。mRNA是已经转录加工过的RNA，即无内含子的遗传密码携带者。在逆转录酶作用下，以mRNA为模版逆转录合成互补DNA (cDNA)，加上接头后，即可与载体连接成重组分子。 构建cDNA文库和直接逆转录都属于逆转录法。 建立cDNA文库 cDNA的克隆对于特定基因的分离和特性研究是极有价值的。 cDNA文库的最关键的特征是它只包括在特定组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列，这样使cDNA文库的复杂性要比基因组文库低得多。 由于不同细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达决定的，因此各自的mRNA种类不同，其cDNA文库具有独特性。 若选择的细胞或组织的类型得当，可容易地从cDNA文库中筛选出所需的基因序列。 建cDNA文库的一般步骤 分离表达目的基因的组织或细胞 从组织或细胞制备总RNA和mRNA cDNA第一条链的合成 cDNA第二条链的合成 cDNA的甲基化和接头的加入 双链DNA与载体的连接 分离表达目的基因的组织或细胞 为最大限度地获得目的基因，避免其它组织或细胞来源基因的混杂，应尽量避免其它组织和细胞类型的污染。 为得到全长的cDNA，所用材料要尽可能新鲜。 从组织或细胞制备总RNA和mRNA 从有限量的起始材料组建cDNA文库的主要限制是能否得到足够量的模板RNA。 为增加RNA的回收，可用硫氰胍或酸性硫氰胍-酚-氯仿等微量RNA分离法及载体RNA共沉淀法来制备RNA。所用载体RNA必须与目的RNA有明显区别，不作为模板参与cDNA的合成。 如材料有限应直接用总RNA建cDNA文库。 如起始材料不受限制，一般用oligo(dT)纤维素柱亲和层析分离出poly(A)? RNA作为cDNA合成模板。这可降低文库的复杂性，大部分mRNA序列可富集50倍左右。mRNA的相对含量增加于细胞内丰度较低的mRNA cDNA的合成是有利的，但在poly(A)? RNA的纯化过程中也可能造成某些基因序列的丢失。 cDNA第一条链的合成(1) 合成需要RNA模板、cDNA合成引物、反转录酶、四种脱氧核苷三磷酸和相应的缓冲液。 模板可以用总RNA或poly(A)? RNA。 引物通常用oligo(dT)(12～18)或由小牛胸腺DNA制备的随机引物(5～6nt)。 合成的质量可用碱性琼脂糖凝胶电泳检测。 cDNA第一条链的合成(2)：oligo(dT)引物 用oligo(dT)的优点是可最大限度地减少po