06毛细管等电聚焦.ppt

Capillary Iso-Electric Focusing (CIEF) 毛细管等电聚焦 Capillary Iso-Electric Focusing-CIEF 高分辨率（分辨率可达0.005 pH） 快速 微量 在柱检测 CIEF 中的谱带移动 正极移动：在正极加电解质如NaCl，使聚焦后分离的谱带向该极移动 负极移动：在负极，加电解质如NaCl，使聚焦后分离的谱带向该极移动 压力移动，加电压的同时施加压力，实现移动的同时保持聚焦状态 扫描检测分离谱带，无需谱带移动 CIEF试验要点 内壁经处理的毛细管 两性电解质（～1％）和样品充入毛细管 电极液－20 mM 磷酸为阳极液，20 mM NaOH为阴极液 加电压聚焦，4～6kV，聚焦稳态后电流下降到起始的10～25％ 聚焦区带的转移和检测 * * 等电点，pI 正负电荷相等时对应的pH 两性离子 细胞色素C 10.6　　　 胰蛋白酶原 9.2 鲸肌红蛋白 7.6 马肌红蛋白 6.6 Beta-乳球蛋白 5.2 转铁蛋白 4.3 pI＝7的蛋白质在不同pH处的荷电情况 等电聚焦的原理 具有一定pI的蛋白在电场中建立的pH梯度介质中，当所处位置的pH低于pI时带正电荷，向负极移动；在高于pI的pH位置时带负电，向正极移动；在等于pI处不动。不同等电点组分被聚焦在不同位置而达到聚焦和分离的目的。 如何在电场方向上产生pH梯度？ 如何维持建立的pH梯度的稳定？ 毛细管中pH梯度的建立 CH2=CH COOH CH2=CH NH2 (CH2-CH)m NH2 (CH2-CH)n COOH 丙烯酸 乙烯氨 聚两性电解质 两性电解质的合成 0 + - pH/ x 阳极端(酸性电解质） 阴极端（碱性电解质） 两性电解质的电荷与pH的关系 0 + - pH/ x 阳极端 阴极端 pI 两性电解质中的蛋白 CIEF操作过程 CIEF分辨能力取决于： 扩散系数 电场强度 pH梯度 淌度的pH梯度 x pH 阴极端 阳极端 阳极移动示意图，阳极加入中性盐 x pH 阴极端 阳极端 阴极移动示意图，阴极加入中性盐 CIEF中加电加压转移方法 CIEF分离蛋白混合物 CIEF Analysis of anti-CEA MAb CIEF测定等电点 CIEF蛋白定量分析 CIEF分析过程：载入，聚焦，迁移（检测） 操作注意事项 浓缩沉淀： 由于局部高度浓缩，有可能导致蛋白沉淀阻塞。需要加添加剂，如PVA等对蛋白质pI影响小的非离子表面活性剂。 检测：因为通常所用两性电解质在低UV有吸收，因此UV检测通常在较高波长，即280 nm进行。 被稀释 被浓缩 区带浓度 塞状进样 混合在支持电解质中 进样方法 随时间变宽 随时间变窄 区带宽度 淌度 缓冲溶液 等电点 两性电解质 原理 电解质 CZE CEIF 比较 CIEF和CZE比较 两性电解质系由分子量为300－2000的乙烯多胺和丙稀酸聚合形成，总碱的pKa和总酸的pKa决定pH范围。根据合成条件不同，可形成不同pH范围的两性电解质。 * *