《DNA重组技术应用基本工具》讲义新人教选修.pptVIP

什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 SmaⅠ 平末端　　　平末端 Go back 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。 二、“分子缝合针” —— DNA连接酶 ①作用: 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来. ②作用原理： 催化磷酸二酯键形成 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， E·coli DNA连接酶　　　　　　　　或T4DNA连接酶 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 　 T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低 T4DNA连接酶 ③类型： 类型 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复 磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端(效率较低) 相同点 差别 寻根问底 DNA连接酶与DNA聚合酶的异同 不同点： 1.都形成磷酸二酯键 1)DNA聚合酶：需要模板，连接单个核苷酸形成互补单链 2)DNA连接酶：不需要模板，连接DNA片段形成双链DNA 2.化学本质都是蛋白质（但组成和性质各不相同） 相同点： 三、“分子运输车” ——基因进入受体细胞的载体 1、载体的作用 将 转移到受体细胞中去。 目的基因 2、种类 质粒（常用），最常用的质粒是大肠杆菌的） λ噬菌体的衍生物 动植物病毒 3、载体需要的条件： 　⑴有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 　⑵对受体细胞无害 　⑶能够在受体细胞中自我复制并稳定地保存 　⑷有某些标记基因，便于筛选 　⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能有预想的效果吗？ 　⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？ 　⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？ 　⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？ 1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。 4、质粒是基因工程最常用的载体。 2）质粒DNA上有一个或多个限制酶的切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 3）携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA进行同步复制。 4）质粒DNA上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别 5）真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。 2 7 4 8 3 6 1 5 天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？ 提示： 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？ 不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件： 思考与探究 P7 1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 2） 载体DNA必需具备自我复制的能力或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制的能力。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？ 迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。 思考与探究 P7 什么是内含子和外显子？ 原核细胞基因的编码区是连续的， 真核细胞基因的编码区是间隔的、不连续的. 真核生物基因的结构特点是：“编码区是间隔的、不连续的。”也就是说：能够编码蛋白质的序