实验二sdspage凝胶电泳.pptxVIP

SDS凝胶电泳;实验原理;源起;丙烯酰胺;基本原理之一;基本原理之二;分类;电泳槽;不连续系统;浓缩胶;凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。;浓缩效应之二; 样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。;电荷效应之二;电荷效应之三;SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。;凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：;上样缓冲液之一?;上样缓冲液?之二;上样缓冲液?之三; 增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。 指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。 ; 单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。Carnoy固定??（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24 h，冰箱、室温均可。 ;甲醇/冰醋酸固定液;染色剂;? 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 ;考马斯亮蓝;实验步骤;（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8): 称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （６）TEMED（四甲基乙二胺）;（７）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml （８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀 （９）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用;（1０）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml （1１）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml ;（12）高分子量标准蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200兔肌动蛋白 MW=43,000牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 （13）样品：兔血清;２.