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In-Fusion克隆技术介绍宝日医生物技术（北京）有限公司主要内容In-Fusion?技术原理 1In-Fusion?应用文献In-Fusion?实验方法In-Fusion?应用实例 3 2 4 In-Fusion克隆技术介绍In-Fusion酶In-Fusion?技术原理示意图50 ℃，15 min单管反应Clontech专利 In-Fusion克隆技术介绍In-Fusion?技术特点不受载体限制不受酶切位点限制In-Fusion不附加任何冗余序列阳性率高达80%一次反应单管操作 In-Fusion克隆技术介绍主要内容In-Fusion?技术原理 1In-Fusion?应用文献In-Fusion?实验方法In-Fusion?应用实例 3 2 4 In-Fusion克隆技术介绍In-Fusion?引物设计黏性末端（5’ 悬挂）缺失酶切位点部分碱基 平末端黏性末端（3’悬挂） In-Fusion克隆技术介绍In-Fusion?引物设计在线工具片段与载体用量计算工具PCR引物转换工具在线工具网址/CN/Support/Online_Tools/CN/Support/Online_Tools In-Fusion克隆技术介绍PCR扩增酶切处理载体线性化 In-Fusion克隆技术介绍建立In-Fusion?连接体系Rxn ComponentCloning Rxn5× In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μlLinearized vector x μl* Purified PCR Fragment x μl** ddH2O x μlTotal Volume 10 μlLinearized vector : Purified PCR fragment (摩尔比)=1:2*0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, 10 kb: 50-200 ng**10 kb: 50-100 ng, 10 kb: 50-200 ng In-Fusion克隆技术介绍主要内容In-Fusion?技术原理 1In-Fusion?应用文献In-Fusion?实验方法In-Fusion?应用实例 2 4 3 In-Fusion克隆技术介绍In-Fusion?应用多片段克隆构建载体模型插入突变位点高通量克隆 In-Fusion克隆技术介绍In-Fusion?应用实例In-FusionTM assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Baogong Zhu, Guifang Cai, et al. BioTechniques, Sep 2007; 43:354-359 In-Fusion克隆技术介绍简便、快速、高效的克隆技术In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。 In-Fusion?应用实例---多片段连接多片段连接---构建真正无缝融合蛋白 将白细胞介素2(IL-2)分泌信号序列与CD101胞外域序列（删除内源性信号序列）和鼠免疫球蛋白G3(IgG3)的可结晶片段进行融合，构建无缝融合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc ，并将其转染COS细胞检测表达情况。实验流程设计引物；扩增目的片段及载体线性化；建立In-Fusion连接反应体系。 In-Fusion克隆技术介绍In-Fusion?应用实例---多片段连接引物设计并扩增目的片段IL-2 Signal, CD101和Murine IgG3 IL-2 Signal with Overlaps to NcoI-Digested Vector and CD101, 88-bp PCR ProductSense (NcoI underlined)5′-TTCAAATCCACCATGGATAGAATGCAATTGTTG-3′Antisense5′-CTGTTACTTCTCTCTGAGAATTCGTAACCAAAGCCAAAGACAAAGCAATCA-3′CD101, 2799-bp PCR ProductSense5′-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3′Antisense5′-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3′Mur