《基因工程讲稿-5-2》-公开课件.pptVIP

※ 由于在腺病毒的两段反向末端重复序列中，只要有一段是完整的，另一段的缺失也就能够得到恢复。因此，可以利用靠近5’-末端的El早期基因区克隆外源基因。例如已经证明，Ad2左边末端片段在体外克隆和突变之后，再连接到缺失了左边末端片段的Ad5基因组DNA上，这样的重组体分子感染了人细胞之后，会正确地再生出左边末端片段，从而恢复了腺病毒DNA的末端重复结构，而且子代病毒DNA也是具有感染性的。 ※ 应用上述办法，已在El早期基因区引入了若干突变，但假若不提供辅助功能，如此形成的重组的腺病毒是不能够在人HeLa细胞中生长的。同样的道理，如果通过这种办法将外源基因插入在El早期基因区，也就必须提供辅助功能才能完成感染周期。现在通常是用能表达El功能的人细胞系(293细胞)提供这种辅助功能的。 因为腺病毒并不能够感染猿猴细胞，而含有SV40病毒T-抗原的重组分子却可以在这种细胞中表达。 ※ 因此，构建腺病毒-SV40重组载体可以扩大腺病毒的感染范围，能够在其它非受体细胞(如猿猴细胞)中有效地生长。在体外已经构建成的这类腺病毒-SV40重组载体中，T-抗原基因的表达是在腺病毒主要的晚期启动子控制下进行的。这种类型的腺病毒载体有可能得到进一步的发展。 谢谢！ 第三步：应用正负选择法分离出已成功地敲除掉了目标基因的ES细胞克隆，这样的ES细胞系亦叫做突变的ES细胞。 第四步：挑选生活力旺盛的突变的