微生物学第5章病毒.ppt

* 2 噬菌体效价测定方法—双层琼脂平板法 （1）噬菌体适当稀释 （2）地层平板（2%琼脂培养基7~8ml） （3）上层平板 噬菌体稀释液 0.1ml 对数生长期宿主菌悬液 0.2ml 0.8%琼脂培养基（55℃），3~5ml （4）37℃，8~12h （5）观察噬菌斑 * 3 噬菌体的分离 （1）对数生长期宿主细胞 （2）取样加入宿主细胞悬液，培养。 （3）稀释 （4）测PFU/ml（噬菌斑形成单位） * 噬菌体分离 可疑材料接种培养 过滤除菌 滤液（含多种噬菌体） 加指定宿主菌培养特定噬菌体 培养液变澄清-------分离噬菌体成功 溶菌空斑实验 空斑接种入相应宿主菌液培养 纯噬菌体 * 四、一步生长曲线 (one-step growth curve ) 将敏感宿主菌培养物与相应噬菌体混合一定时间，加入抗噬菌体血清消除过量的游离噬菌体。 培养后，每隔一定时间取样，接种含宿主菌平板，测定噬菌斑数。 以培养时间为横座标，以噬菌斑数为纵座标作图，绘制的曲线即噬菌体的一步生长曲线。 * 1 测定方法 （1）用噬菌体的稀释液去感染高浓度的宿主细胞（敏感菌）以保证每个细胞至多不超过一个噬菌体吸附。 （2）经数分钟吸附后，混合液中加入一定量的噬菌体的抗血清，以中和未吸附的噬菌体。 （3）用保温的培养液稀释上述混合液，同时可中止抗血清作用。 （4）培养（eg：37℃） （5）定时取样，测噬菌体效价。 （6）以噬菌体效价为纵坐标，培养时间为横坐标，绘图一步生长曲线 * 2 三个阶段 潜伏期(1atent period)—噬菌体感染宿主细胞后到释放前的这段时间； 突破期(rise phase)或裂解期—菌体破裂，噬菌体数目增加，直至达到最高值； 平稳期（plateau）—突破期后噬菌体数目不再增加，达到稳定值。 平均收获量(average yield of phage)或爆破量(burst size)—每个被感染的细菌释放的新的噬菌体平均数。 * 3 人为裂解（用氯仿） 隐晦期出现，是噬菌体开始装配的时期。 * 五、噬菌体与宿主细胞生活周期 1 温和噬菌体、烈性噬菌体、前噬菌体概念 （1）烈性噬菌体—感染宿主细胞，增殖，宿主细胞裂解，死亡。 （2）温和噬菌体—噬菌体DNA整合入细菌染色体中，以前噬菌体形成一代代传下去。 （3）前噬菌体—整合入宿主细胞的DNA核酸。 * 2 溶源菌 （1）定义—指在核染色体上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌。 （2）特点—自发裂解，几率10-2~10-5。 （3）诱导—溶源菌在外界理化因子的作用下，发生高频率裂解的现象。eg：UV，X-ray，DNA合成的抑制剂丝裂酶素等。 （4）免疫性—任何溶源菌对以感染的噬菌体外的其他噬菌体（温和或烈性）都具有抵制能力。 （5）复愈—在增殖过程中丧失前噬菌体，几率10-5。 * 图5-42 温和噬菌体和宿主的生活周期 * 噬菌体生活周期 烈性噬菌体 吸附穿入 增殖 成熟 裂解 温和噬菌体 整合 同步复制 自发或诱导 （自发几率10-2-10-5） 裂解性循环 溶源性循环 多次循环传代 * 3 溶源转变—溶源菌表型发生变化 白喉棒杆菌（不产毒）→?温和噬菌体→产毒株 肉毒梭菌→温和噬菌体→产C型或D型毒素 * 4 检验溶源菌的方法 （1）少量溶源 + 大量敏感指示菌→倒平板/培养→溶源菌周围形成特殊噬菌斑（透明的裂解圈）； （2）实验菌 + 宿主菌 → 噬菌斑 实验菌 + 宿主菌 → 诱导 → 噬菌斑 →→比较得出实验菌是否为溶源菌。 * 六、噬菌体的应用 1 细菌的分型，鉴定。 2 分子生物学研究工具—载体。 3 发酵工业 ???? 防止phage污染，选育抗噬菌体菌株。 * 第四