Western-blot原理和技术-新版.pptVIP

为什么要作蛋白质印迹实验？ 研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blotting 方法一: 直接法 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 Western Blotting 方法二: 间接法 优点： 1. 免疫特异性不受标记影响 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3. 多种标记的二抗可供选择 4. 可选择不同的Marker 缺点： 1. 交叉反应引起的非特异性条带 2. 额外的二抗孵育以及条件优化 间接Western Blotting操作流程: Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 Western Blotting 设计选择 分子量标准 内参 膜 转膜和封闭 抗体 显色 不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择 预混分子量标准 高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准 预染分子量标准 单色预染 多色预染 修饰分子量标准 预混分子量标准 高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准 预染分子量标准 单色预染 多色预染 修饰分子量标准 糖基化 磷酸化 荧光标记 不可不加--内参的选择 原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差 种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 用法： 二抗孵育时加入HRP标记内参抗体 分子量相差不大 分子量大小相差比较明显 原料是基础--膜 选择种类 NC PVDF 尼龙膜 选择标准 a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c. 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜 膜的特点 抗体的选择 作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。 八仙过海，各“显”神通--显色方法 化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法： Krypton ?荧光底物 两种常用检测酶系统的比较 掌握 Western blotting的原理和主要步骤。 * * Western blotting Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354. 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色