DNA重组技术的基本步骤-新版.pptVIP

1、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也可以是一些具有调控作用的因子。 2、目的基因获取方法： Ⅰ、从基因文库中获取目的基因 Ⅱ、利用PCR技术扩增目的基因 Ⅲ、化学方法直接人工合成 Ⅰ、从基因文库中获取目的基因 基因文库的构建过程 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。 Ⅱ、利用PCR技术扩增目的基因 PCR的全称： 聚合酶链式反应 PCR的原理： DNA复制 PCR技术扩增目的基因的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。 利用PCR技术扩增目的基因 启动子的作用： 1、什么是转化？ 2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？ 3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？ 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？ 1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？ 2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？ 3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什么？ 归纳: 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定： 2、基因表达载体的组成 目的基因 启动子: 终止子: 标记基因等 一段有特殊结构的DNA片段。 位于基因的首端。 一段有特殊结构的DNA片段。 位于基因的尾端。 终止子作用： 使转录在所需要的地方停止。 标记基因作用： 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。 是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 3、基因表达载体的构建目的： a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 b.使目的基因能够表达和发挥作用。 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 注意 目的基因与运载体结合所需的条件有 ①同一种限制酶 ②具有抗性基因的质粒 ③RNA聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸 ⑦ATP A．①②③④⑤⑥⑦ B．①②④⑤⑥⑦ C．①②③④⑤ D．①②④⑤⑦ （多选）一个基因表达载体的构建应包括 A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因 ABCD D 下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别 A 转化 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 常用的受体细胞： 原核生物：大肠杆菌、 枯草杆菌 、土壤农杆菌 真核生物：酵母菌和动植物细胞 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 1.目的基因导入植物细胞 常用的方法: 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 农杆菌的特点: c.Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 b.具有趋化性。