油橄榄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

124 2015, Vol.36, No.07 食品科学 ※生物工程 油橄榄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其 在毕赤酵母中的表达 1 1,* 1 2 2 2 陈文拴 ，黄乾明 ，陈华萍 ，杨泽身 ，王安逸 ，苏光灿 （1.四川农业大学理学院，四川 雅安 625014 ；2.凉山州中泽新技术开发有限责任公司，四川 西昌 615000 ） 摘  要：采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction ，RT-PCR ）、融合 ’ 引物嵌套PCR （fusion primer and nested integrated PCR ，FPNI-PCR ）与3 -cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA end ，RACE ）技术相结合，从油橄榄（Olea europaea ）中克隆得到苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase ，PAL ）基因全长，命名为OePAL 。序列分析表明，OePAL 的DNA全长2 970 bp （GenBank登录号 KJ511867 ），含一个内含子（393～1 220 bp）；全长cDNA有2 142 bp （GenBank登录号KJ511868 ），开放阅读框 编码713 个氨基酸，与其他植物有较高的同源性。利用该基因构建重组质粒pPICZα A-OePAL，且在毕赤酵母X33 中进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis， SDS）检测显示该重组酶的分子质量在77.5 kD左右，纯化后的酶比活力为196.3 U/mg。酶学性质研究表明： 2+ + L 该重组酶的最适反应条件为40 ℃，pH 8.8 ；在供试范围内Cu 与Na 可以提高该酶活性；以 -苯丙氨酸为底物，在 最适条件下该酶的Km为4.89 ×10－4 mol/L 。结果表明成功地克隆到OePAL，构建了表达载体，并进行了功能验证。 关键词：苯丙氨酸解氨酶；基因克隆；表达载体；毕赤酵母X33 Cloning of Phenylalanine Ammonia Lyase Gene from Olea europaea and Its Expression in Pichia pastoris 1 1,* 1 2 2 2 CHEN Wenshuan , HUANG Qianming , CHEN Huaping , YANG Zeshen , WANG Anyi , SU Guangcan (1. College of Science, Sichuan Agricultural University, Ya ’an 625014, China; 2. Liang Shan Zhong Ze New Technolo