油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳.pdfVIP

２００９年１２月 中国油料作物学报 ２００９，３１（４）：４２６－４３３ Ｃｈｉｎｅｓｅｊｏｕｒｎａｌｏｆｏｉｌｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅｓ 油菜不同器官高质量总蛋白提取方法 和双向电泳体系的优化 １，２ １ ２ ２ ２ 刘海衡 ，胡胜武 ，刘胜毅 ，黄军艳 ，董彩华 （１．西北农林科技大学农学院，陕西 杨凌７１２１００； ２．中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学重点开放实验室，湖北 武汉４３００６２） 　　摘要：以显性核不育油菜Ｓｈａａｎ－ＧＭＳ不育株和可育株的花序和叶片为材料，采用ＴＣＡ（三氯醋酸）－丙酮法 提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白，对总蛋白提取方法、ＩＰＧ（固定ｐＨ梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量 等环节进行了优化。结果表明，采用理想的蛋白质裂解液（７ｍｏｌ／Ｌ尿素，２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，４％ ＣＨＡＰＳ（３－［３－（胆酰 氨丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐），６５ｍｍｏｌ二硫苏糖醇，０．５％ ＩＰＧ缓冲液 ｐＨ３～１０或ｐＨ４～７，全蛋白酶抑制片剂 （片／１０ｍＬ））裂解蛋白，以１５０ｇ上样，按 ＩＥＦ程序 （３０Ｖ，１２ｈ；２００Ｖ，１ｈ；５００Ｖ，１ｈ；１０００Ｖ，０．５ｈ；１００００Ｖ，２ｈ； μ Ⅱ １００００Ｖ，８ｈ）进行等电聚焦，１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶浓度进行第二向电泳，银染方法检测，可得到背景清晰、分辨率较高 的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油 菜蛋白质组学研究奠定技术基础。 关键词：甘蓝型油菜；花药；花蕾；叶片；总蛋白提取；双向电泳 中图分类号：Ｓ５６５．４０３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００７－９０８４（２００９）０４－０４２６－０８ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓｏｒｇａｎｓ １，２ １ ２ ２ ２ ＬＩＵＨａｉｈｅｎｇ ，ＨＵＳｈｅｎｇｗｕ，ＬＩＵＳｈｅｎｇｙｉ，ＨＵＡＮＧＪｕｎｙａｎ，ＤＯＮＧＣａｉｈｕａ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｃｈｉｎａ；２．ＯｉｌＣｒｏｐｓＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＯｉｌＣｒｏｐＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｂｕｄｓ，ａｎｔｈｅｒｓａｎｄｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｕｓｉｎｇＴＣＡ（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）－ａｃｅｔｏｎｅ ｍｅｔｈｏｄｆｒｏｍｓｔｅｒｉｌｅａｎｄｆｅｒｔｉｌｅｐｌａｎｔｓｏｆＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ．ｄｏｍｉｎａｎｔＧＭＳ（ｇｅｎｉｃｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｅ）ｌｉｎｅＳｈａａｎ－ＧＭＳ． Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆａｃｔｏｒｓｉｎｃｌｕｄｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｔｙｐｅｓｏｆＩＰＧｓｔｒｉｐ，ｆｏｃｕｓｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｇｅｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｌｏａｄ ｉｎｇｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｓａｍｐｌｅｓ．Ｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙ２－ＤＥｍａｐｗｉｔｈｌｏｗｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ：ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｌｙｓｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ（７ｍｏｌ／ＬＵｒｅａ，２ｍｏｌ／ＬＴｈｉｏｕｒｅ