基因工程复习知识点-内蒙古农业大学.docVIP

基因工程知识点总结 代课老师尹俊 10级生计2左俊整理 PAGE 14 《基因工程》复习参考知识点总结 代课教师：尹俊 整理：左俊 说明： eq \o\ac(○,1)内容来源：网络，笔记，教材和个人理解。个人整理错误或者理解有误的地方，请自行改正，本人整理内容仅供参考。 eq \o\ac(○,2)时间有限，整理仓促，资料有限，导致内容详略不一，请参考老师给的重点，添加缺少的内容，较详细啰嗦的内容可选择性参考。 eq \o\ac(○,3)内容前后安排大致和老师所讲的顺序以及教材保持顺序一致。 绪论（内容略） 基因工程基本技术 分子杂交 分子杂交（hybridization) :有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。 Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交进行检测。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。 Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交进行检测。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。 Western 印迹法：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤: (1) DNA提取 (2) 酶切DNA (3) 凝胶电泳分离各酶切片段 (4) 使DNA原位变性 (5) 转膜 (6) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点 (7) 探针与DNA杂交 (8) 通过放射自显影检查目的DNA Northern 杂交步骤： (1) 取表达目的基因的组织样品 (2) 总RNA提取 (3) 分离mRNA (4) RNA电泳 (5) 转膜 (6) 预杂交 (7) 探针杂交 (8) 放射自显影 原位杂交 原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA，再将DNA烘干固定于膜上，与标记的探针杂交，检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。 PCR PCR原理：变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。 影响PCR扩增的影响因素： (1)聚合酶（TaqDNA聚合酶，易在3′末端加A；Pfu聚合酶，高保真性，合成长片段和平末端） (2)dNTPs的浓度； (3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。 (4)引物浓度：0.1-0.5μmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体； (5)Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L，影响酶的活性、引物-模板退火、特异性； (6)PCR反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度Tm与时间、引物延伸温度与时间和循环数 引物设计原则： （1）引物长度以18-25 bp为宜。 （2）碱基尽可能随机分布,G+C占20-80%。 （3）引物内部避免形成二级结构。 （4）两引物间避免有互补序列。 （5）引物3’端为关键碱基，必须完全互补；5’端无严格限制，可加入酶切位点。 （6）上下游引物退火温度相差5℃以内。 （7）内部避免重复序列。 PCR特点： eq \o\ac(○,1)特异性强 eq \o\ac(○,2)敏感性高 eq \o\ac(○,3)快速 eq \o\ac(○,4)简便 eq \o\ac(○,5)可扩增RNA或cDNA eq \o\ac(○,6)对起始材料质量要求低 eq \o\ac(○,7)单核苷酸错误掺入 PCR分类 1)不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板. 制备杂交探针. 基因组DNA结构功能的研究 2)反向PCR (reverse PCR)： 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已