丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒说明书.doc

PAGE 2 1150456205 丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（PCR-荧光法） 说明书 【产品名称】 通用名：丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（PCR-荧光法） 英文名：PCR-Fluorescence Detection Kit for Hepatitis C Virus RNA 汉语拼音：Bingxing Ganyan Bingdu Hesuan Dingliang Ceding Shijihe （PCR -Yingguang fa） 【包装规格】 32人份/盒 【预期用途】本试剂盒用于丙型肝炎的辅助诊断及疗程监控。 【原理和应用】 本试剂盒利用一对丙型肝炎病毒（HCV）的特异性引物，一条特异性荧光探针，采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种单体核苷酸（dNTPs）等成分，并应用RT-PCR技术实现对HCV RNA保守基因的扩增，同时通过外标的方法实现对血清或血浆中的丙型肝炎病毒进行定量检测。 本试剂盒可作为丙型肝炎的辅助诊断及疗程监控。 【试剂盒组成】 组成成分 规格 样本处理试剂 裂解液 DEPC水（无Rnase和Dnase的水） 核酸扩增试剂 RT-PCR主反应液 酶混合液 荧光探针 对照品 阴性对照 强阳性对照（非感染性体外转录RNA） 107~106IU/ml 临界阳性对照（非感染性体外转录RNA） 104~103 IU/ml 校准品* 定量校准品1# （1.0-8.0）×104IU/ml 定量校准品2# （1.0-8.0）×105IU/ml 定量校准品3# （1.0-8.0）×106IU/ml 定量校准品4# （1.0-8.0）×107IU/ml 4ml×2 400ul×1 1ml×1 20ul×1 14 ul×1 350ul×1 350ul×1 350ul×1 50ul×1 50ul×1 50ul×1 50ul×1 * 定量校准品具体的参数根据批号不同而不同。详见试剂盒内给定值。 【储存条件及有效期】 裂解液为黄色液体，保存于4℃ 其他试剂目测为透明液体，保存于-20℃ 全融化，并充分振荡混匀后稍事离心； 所有试剂应避光保存； 有效期十二个月。 【自备物品】 1. 自备试剂（分析纯） 氯仿、异丙醇（-20℃预冷）、75%乙醇（用不含Rnase和Dnase的水配制，-20 2. 自备仪器 高速台式冷冻离心机、移液枪、一次性耗材（无酶吸头、离心管、手套、帽子等）、专用工作服、工作鞋、办公用品等。 【适用仪器】 PE-5700，PE-7000，PE-7300，PE-7700，Icycler定量荧光PCR仪 【样本要求】 1. 样本种类：血清或血浆 血清以新鲜采集分离为好，采血6小时内必须分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用无RNA酶的无菌微量离心管中。 血浆不能用肝素作抗凝剂。 2. 样本储存：待测样本在2-8℃保存不应超过24hr，-20 -70℃ 3. 避免反复冻融（最多冻融三次）。 4. 样本运输：在冷冻状态下运输。 【使用方法】 1. 样本处理（样本处理区） 取n个1.5ml无RNA酶的离心管（n=样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照 +1管阴性对照），作好标记。 在上述每一管中加入待测样本血清、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照各100ul， 然后再各加入300ul裂解液，尽快用吸头反复吸打或轻微振荡混匀（每样本换用一个吸头），再加入100ul氯仿，振荡混匀5sec或颠倒混匀15次（以无肉眼可见的白色块状沉淀为准；注意不宜过于强烈，避免产生乳化层影响分层）。 13000rpm离心10min（注意固定离心管方向，有条件的可在4℃ 取与步骤1相同数量的离心管，各加入200ul异丙醇（-20℃ 取步骤3各管中的上清转移至相应的管中（在尽量吸尽上清的同时注意不要吸取中间层），颠倒混匀。 13000rpm离心10min（注意固定离心管方向）。 轻轻倒去上清或用吸头吸干液体，加入500ul75%乙醇，颠倒洗涤。 13000rpm离心5min（注意固定离心管方向），轻轻倒去上清或用吸头吸干液体。 7500rpm离心5sec（注意固定离心管方向），用吸头尽量吸干被甩至管底的残余液 体（一份样本换一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀的一面），室温干燥1-5min（干燥时间随残余液体的吸干程度而不同，以沉淀表面无肉眼可见水珠为准；不宜过分干燥，以免RNA不溶）。 各加入10ulDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，稍微离心，冰上保存备用 （请在2小时内用于PCR扩增），暂时不用时保存于-20℃