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脂肪酶测定方法的探讨 目 录 中文摘要： 对碱性脂肪酶酶活的测定方法进行了研究, 通过根霉发酵产脂肪酶和酶的粗分离基本可得到纯度较好的酶的组分，对分离酶过程中的硫酸铵浓度的影响进行研究，得到能不影响酶活的最佳硫酸铵浓度，对脂肪酶的最佳反应pH进行测定，并研究在最佳pH下缓冲液的离子浓度等对酶活测定是否造成影响。 关键词： 脂肪酶；制备；粗分离；酶活力。 0 前 言 碱性脂肪酶在国际市场上还是一个新 酶种。碱性脂肪酶是在 碱性条件下 水解的 脂肪酶，生产的主要原料为 小麦、 玉米等农副产物，通过生物 发酵技术转化。它可以水解天然油脂，产生 脂肪酸和 甘油，是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。 　　由于三磷酸钠作为助洗剂在洗涤剂中的大量使用，导致了江河湖泊产生“过肥化”，给生态环境带来危害。于是许多国家在开发具有良好效果的低磷或无磷洗涤剂，酶作为一种助洗剂正是顺着这个潮流而发展起来的[1.2」。又因为洗涤剂中碱性的居多，尤其是家庭用洗涤用品，所以各种应用于洗涤剂行业的碱性酶制剂大量产生。国外加酶洗涤剂在洗涤剂总产量中的含量近年来也逐年升高，其中日本加酶洗涤剂高达95%左右;西欧达90%。国内目前在各种洗涤剂用酶上的研究也己有很大进展。脂肪酶是一种高活性的生物催化剂，对脂类化合物分解有催化作用，反应是在油水界面上进行的。它可使甘油脂水解成一甘油二脂、单甘脂和脂肪酸，因而利于衣物中皮脂类污垢的除去。同时反应不须要辅助酶，[4〕且本身无毒，并能被生物完全降解，.对环境无污染。 我们常用各种含酶洗衣粉，其中的酶制剂主要有 碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。碱性蛋白酶用于分解 蛋白质类污物，如汗渍、血渍等。碱性脂肪酶则主要作用于脂肪酸及其酯类污物，也就是我们通常所指的油污类。 脂肪酶的水解底物一般为天然油脂,其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键,反应产物为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。该反应的重要特征是异相系统反应,即在油-水的界面上作用[1],再加上酶解反应本身是一个机制十分复杂的催化反应,反应速度较慢,这就决定了反应的不稳定性。许多因素都会影响酶解反应的速度,如反应底物的种类及形态、稳定时间、反应体系的酸度、温度等。脂肪酶可将甘油酯（油、脂）水解，在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。 　　反应式为：RCOOH+NaOH =RCOONa+H2O 脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。 　　0.1 脂肪酶的来源 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。 0.2脂肪酶的应用 0.2.1食品工业 利用酶作用后释放出的链较短的脂肪酸，增加和改进食品的风味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯，作调料剂；用有1,3－专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的花色品种，制备代可可酯等高档油脂；另外，脂肪酶还可以用于酒类的去浊除渣、改善面包质量，改善蛋白的发泡等等方面。利用脂肪酶来生产兼具机能性与保健疗效的新结构油脂及其衍生物，例如油脂改造 ( 例如可可脂替代品、增加一般动植物油脂中 PUFA 的含量。 ), 乳化剂 ( 例如 glucose esters), 抗氧化剂 , 香料等，不仅增加油脂的广泛应用性，也提升油脂工业的经济效益与发展潜力。 0.2.2洗涤剂工业 Novo公司首先将含脂肪酶的洗涤剂推向国际市场，作为洗涤剂的增效剂，该酶在15～60℃、pH9.0以上的条件下可去除油污。用来做为家庭或工业用清洁剂的添加物，是脂肪酶的最大商业应用领域。根据统计， 1995 年全球的酵素销售总值约在 3