凝胶层析原理.pptxVIP

小 结 ;层 析CHROMATOGRAPHY;一、概述 ;分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力分子亲和力吸附能力;;1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;;1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代 色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC);1958年，Stein???Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构 1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)仪 1975年，Small等提出离子色谱?? ? 20世纪80年代，超临界色谱 20世纪90年代，毛细管电泳（1809年Re?ss第一次电泳实验） 21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展; 层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。;气 相 层 析;2.按层析的机制可分为;定义 指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法;吸附层析;（2）分配层析;柱层析colum chromatography 进样量大且容易回收 薄层层析thin layper chromatography 小量样品，快速， 操作简便;;纸层析;三.层析的一般原理 ;纯化生物物质的纯度 取决于混合物中各组分K 值的差异程度 混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离 ; ;凝胶层析Gel Chromatography;一、基本原理 ;固定相（凝胶）;;凝胶层析过程的数理关系 ;柱床体积VT; Ve –Vo Kd = ———— Vi;(2)Ve = Vo + Vi Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出.;?三.凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定 2.操作条件较温和。 3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化 ;五、凝胶的结构与性能;（2）特点：;;大孔凝胶 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒。;■ 各 种 层 析 胶 体 ：;六.其它条件选择;;测分子量;实验： 凝胶层析法分离蛋白质;血红蛋白 64,480 二硝基苯-鱼精蛋白 2,000-12,000 Sephadex G-50 孔径 1,500-30,000;1、装柱 ※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积 ※凝胶不能有气泡和分层现象 ※装柱结束后要保持凝胶表面平整 ;;2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口 ※加样时尽量不要破坏凝胶面 ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱 ;血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱体积？