三核酸分离与检测.pptxVIP

从哪儿提取（Where）？怎么提取（How）？提到什么程度（What）？会出现什么问题（Questions）？如何解决（Solution）？主要内容核酸提取的原则和基本要求核酸提取的一般过程关键试剂的作用核酸的部分特征核酸提取的常用方法核酸提取经典案例核酸提取的注意事项核酸提取出现的问题及对策核酸提取的相关说明核酸提取的原则和基本要求Principle and steps Principle 保持核酸的完整性；提高核酸的质量（纯度和浓度）。 Requirements for purification不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其他事物大分子（Pr、sugar and lipid）其他核酸污染核酸提取的一般过程Principle and steps I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质?V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 Steps样品准备（取材）破细胞（物理法、化学法、酶法）；除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）；沉淀提纯破碎细胞-方法机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS或CTAB处理细胞；?酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 破碎细胞-来源动物：小牛胸腺?动物肝脏、血液和肌肉组织等?鱼类精子；植物：种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物：谷氨酸菌体含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%（培养过夜）。 Note： 从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。 对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 从高等动植物中提取DNA难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。破碎细胞（来源-方法）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂抽提核酸除去杂质 1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离2．使核酸与蛋白质分离3．除去脂类 4．多糖的除去How to remove ？核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 How to do？核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0关键试剂的作用关键试剂的作用核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。关键试剂的作用核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 关键试剂的作用核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。关键试剂的作用核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC关键试剂的作用核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶 核酸的部分特征核酸的部分特征存在形式pH值影响盐影响温度影响1.存在形式 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。—— removal of Pr2.pH值的