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细胞培养基础知识 覃兆鲜 细胞培养理论部分内容 1、细胞培养概念： 细胞培养是指用机械法或酶消化法从组织中分离出细胞，并摹拟体内环境，在无菌、适当温度、酸碱度和营养条件下，使其生长增殖，并维持其正常结构和功能的一种培养技术 . 2、细胞培养原理： 细胞培养原理简单的来说，就是在体外营造一个同机体内细胞生存环境相似的人工环境，从而可以使细胞在体外生存、生长、增殖 3、体内、外细胞的差异 体内细胞： 机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能 4、体外培养细胞类型 贴壁依赖性细胞 贴附于玻璃、或塑料等无活性物质的表面生长、生存和维持。 悬浮培养细胞 细胞悬浮于液体培养基中增殖。 5、细胞周期 细胞周期：细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程.G0期：细胞不再沿周期进行，进入休眠状态，G1期，----------DNA复制前期，主要进行RNA合成和蛋白质合成，为染色体复制做准备,S期-----------DNA复制期，完成DNA复制 ,G2期----------DNA复制后期，为纺锤丝的形成做准备,M 期:有丝分裂期。 群体中多数细胞处于间期，少数处于分裂期。分裂期较短。 整个细胞周期可划分为G1 → S → G2 → M → G1，如下图所示： 细胞生长曲线 体外培养的细胞生长达到一定密度后，都需传代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。细胞增殖一代，一般要经过以下三个阶段： 细胞生长曲线图:可用MTT法测定。用BRDU检测有丝分裂的细胞。 BRDU （５－ 溴 ２－ 脱氧尿嘧啶核苷 )与胸腺嘧啶结构相似，在DNA合成过程中与胸腺嘧啶一样能掺入细胞DNA中，用BRDU单克隆抗体免疫细胞化学法可检测BRDU标记的结果，可直接观察DNA的合成过程，从而能客观地评价培养细胞的增殖分化情况，同时能避免对细胞的放射性损害。 细胞调亡 细胞凋亡是细胞自身程序结束,生命主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的自主有序的,有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。 细胞凋亡特征 凋亡发生的过程表现（细胞缩小→致密染色质边集→核碎片→凋亡小体） 1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触 区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来 2、细胞缩小：①胞浆细胞器集中 ②胞膜出芽或起泡 ③细胞皱缩； 3、保持胞浆细胞器完整性 扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，①线粒体不肿胀，内膜不破裂；②短暂滑面内质网（SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；③有时有聚积排例的半结晶状核糖体；④可有与细胞表面平行的微丝束。 4、形成调亡小体 由凋亡细胞裂解为若干个由质膜包绕的小体，每个凋亡小体有自己的一簇细胞器。周围不引起炎症反应。 5、核内染色质结构改变（这是最引人注意的改变） 染色质凝集于核膜下表现为： ①核质固缩； ②边集； ③核浆紧实； ④核膜皱折。 Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一，在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧，Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。 细胞体外培养的影响因素 血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)和其它动物血清。 由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。 pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。 渗透压：培养液渗透压一般介于260~320 mosm/kg之间 培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择 贴壁和铺展因子，如某些细胞培养初不易贴壁,可以预先用0.1%明胶或多聚赖氨酸包被瓶皿. 细胞培养基本过程 取材 无菌环境中，从机体取出某种组织（视实验目的而定