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亲和层析生物亲和作用生物亲和作用的本质影响亲和作用的因素亲和作用体系 生物亲和作用的本质生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（affinity purification）。亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。 配基固定化、吸附样品、样品解吸 “亲和吸附剂”：载体与固定化配基的总称具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用配位键 弱共价键 图5-1 蛋白质的结合部位及各种结合作用力 亲和作用体系 将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。 常用的亲和作用体系特异性 亲和作用体系高特异性 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂群特异性 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等） 亲和色谱 亲和色谱的特点 选择性高、特异性极强, 以胰岛素提取胰岛素受体，一步纯化8000倍 分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物亲和色谱的局限性①通用性差，洗脱条件苛刻②费用高 亲和色谱填料亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）。在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的需要，有必要自制亲和吸附介质。 亲和配基配基的选择 足够大亲和力 结合专一 牛胰蛋白酶抑制剂: 除与牛胰蛋白酶, 还与胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶有亲和作用 配基有化学活性 配基的浓度 亲和势较低（ KL ≥ 10-4mol/L），增加配基浓度或增加柱长 大分子配基浓度过高，活性中心相互掩盖， 吸附强，非专一性吸附↑ 理想配基浓度1-10μmol/L，2 μmol/L凝胶 配基分子大小 首选大分子或插入“手臂”偶联位置 e结合有效，偶联位置导致 亲和力差异，可吸附不同配体 亲和配基1. 酶的抑制剂 小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。 底物，亲和力＜抑制剂，专一性较差， 转变为产物，用不适pH，缺少辅因子 辅酶：专一性不强 2. 抗体利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间的Keq一般为107～1012 L/mol。利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。 3. A蛋白protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。4. 凝集素凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。pH＜5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102 kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结合。在利用con A为配基的亲和色谱操作中，操作条件应当适宜。5. 辅酶和磷酸腺苷脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。AMP（adenosine 5-monophosphate）、 ADP（adenosine 2，5-diphosphate）的腺苷部分与上述辅