三基因工程简介旧人教版.pptxVIP

基因工程的基本内容 基因操作的工具 基因操作的基本步骤 基因工程的成果与发展前景 基因工程与医药卫生 基因工程与农牧业、食品工业 基因工程与环境保护;新课标：普通高中课程标准实验教科书;基础理论和技术的发展催生了基因工程;（3）蛋白组分析 蛋白质合成后，还要进行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白质剪切等翻译后修饰，仅从核酸的序列并不能完全描述一个蛋白质。尽管分析不同细胞类型中表达的蛋白已近20年，直到1995年才由Wilkins和Williams提出一个与基因组相对应的名词蛋白组分析的核心技术是蛋白质双向电泳。 ?;H.Boyer S.Cohen;;;;“工欲善其事，必先利其器” DNA重组技术的基本工具;1.限制性内切酶(Restriction Endonuclease);Hamilton Smith, Daniel Nathans (USA) and Werner Arber (Switzerland)－－1978 Nobel prize;限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用) 限制：细菌的自我保护系统病毒的侵染 修饰：修饰系统－防止自杀;限制性内切酶对抗外来DNA; ;第15页/共47页;特点 1）识别序列：4，5 或 6个碱基对 EcoR I识别 5’-G/AATTC- 3’ 序列 3’-CTTAA/G- 5’ 2）180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。 3）任何一个DNA分子，每9对碱基出现一个II类酶切口。 ;限制性内切酶及其缓冲液;第18页/共47页;2.DNA连接酶（DNA ligase）;3.运载体; 理想载体具备四个条件：;;质粒的构建与改造 1)删除不必要的DNA区域，缩小分子量，提高外源DNA片段装载量。 2)灭活某些质粒的编码基因。 3)加入易于识别的选择标记基因。 4）选择标记基因内引入内切酶的识别及酶切位点的序列——多克隆接头(Polylinker)。 5)加入特殊的基因表达调控元件。 ;实验：模拟重组DNA;入-双链噬菌体 ;提取目的基因 目的基因与运载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和表达;基因工程的基本过程 1) 切 用限制性内切酶切开外源基因和载体分子。 2）接 用连接酶将外源基因连接到载体分子上。 3）转 借助细胞转化将DNA重组分子导入细胞。 4）增 培养转化细胞，扩增DNA重组分子。 5）检 筛选和鉴定转化细胞及目的基因。 ? ;鸟枪法(Shotgun) ???某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的片段，分别连接到载体上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，筛选出含有目的基因期望重组子。 鸟枪法局限性： 如同盲人打鸟而得名，工作量很大，克隆含有目的基因的片段。90%真核生物中目的基因中含有内含子，真核生物中目的基因不能在原核细菌中表达。 （1）目的基因组DNA片段的制备。 如：机械切割，用超声波处理，采用合适强度和时间。切割的DNA片段控制一定大小范围内，上限是载体最大装载量，下限应大于目的基因长度。 （2）外源DNA片段的全克隆。 选质粒或DNA作为载体。受体细胞选大肠杆菌。 （3）期望重组子的筛选。 菌落，菌斑原位杂交法，外源基因产物功能检测法。 （4）目的基因的定位。 在已知克隆的DNA片段上准确定位目的基因后，进行序列测定。 ;第29页/共47页;cDNA法：cDNA文库（cDNA Bank） cDNA是与mRNA互补的DNA (Complementary DNA)，将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用逆转录酶在体外合成cDNA，克隆在受体细胞内，筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆。 优点： （1）能选择性克隆蛋白编码基因，由mRNA反转录合成cDNA对特的基因而言只有一种可能性。 （2）cDNA法克隆基因相当“纯净”，不含5’端调控区，剔除内含子结构，有利于原核细胞的表达。 （3）比相应的基因组拷贝要小数十倍，2-3 Kb或更小，便于稳定地克隆在表达型质粒上。 ;;利用PCR技术扩增目的基因;化学合成法：前提 a.如果目的基因的全序列是已知的，用化学合成法直接合成。 b.DNA自动合成仪可合成不超过50个碱基寡聚核苷酸单链。 c.用于核酸杂交的探针，分子克隆的人工接头，PCR扩增的引物。 d.由单链寡聚核苷酸通过退火直接装备双链DNA片段或基因。;基因文库，理论上它含有某一生物染色体的所有DNA片段，包括基因编码区和间隔区DNA。由鸟枪法和cDNA法构建。鸟枪法构建的为基因组文库 (Genomic Bank)。 cDNA文库,含有生物体的全套蛋白质编码序列,不含DNA调控序列从c