分子遗传标记技术.pptxVIP

;1. RFLP; 1.1 RFLP标记技术的原理;RFLP 探针主要来源;;1.2 RFLP标记技术的特点;缺点;包括基因组DNA的酶解和Southern转移； DNA纯度高、重复序列拷贝数高； 防止DNA降解，确保彻底酶切； 限制酶能产生0.5~2kb片段，对甲基化不明显，总酶量少于反应体系的10%； 探针与DNA杂交可用放射性自显影或荧光免疫或免疫过氧化物酶等技术进行观察； 通过直接分析重复序列等寻找能作为探针的潜在重复DNA序列的策略。; 2 RAPD; 2.1 RAPD标记技术的原理;;优点： 无需专门设计RAPD扩增引物，随机设计的长度为9~10bp引物均可使用，无种属特异性； 在初期反应周期中，退火温度为36~37℃为保证退火反应双链稳定性，引物G+C40%； 共显性遗传，不受环境、发育、数量性状遗传影响； 其产物经克隆分析后可转化成RFLP和原位杂交探针，转变为经典PCR技术的分子标记。;缺点;2.3 RAPD标记技术的操作;实验中可能发生的问题及解决方法;2.4 RAPD技术在水产动物中的研究和应用;3.杂交分析和遗传育种 董在洁等(1999)对兴国红鲤、德国境鲤和苏联境鲤进行了RAPD分析，结果表明兴国红鲤与苏联境鲤的遗传距离最大。由此推断这两个品种间的杂种优势较强,并与育种实践一致。 4.基因定位和基因连锁图构建 孙效文等(2000)利用RAPD和SSLP遗传标记建立了鲤鱼的遗传连锁图。 Postlethwait等以单倍体遗传法主要用RAPD绘制了斑马鱼的第一张连锁图，图谱促进了斑马鱼突变基因定点克隆,染色体重排和脊椎动物基因组进化的研究。 ;基于RAPD的SCAR标记;SCAR标记的优点;3 AFLP;3.3.1 AFLP标记技术原理;内切酶;引物是一种人工合成的单链寡聚核苷酸，一般长度是18～20个核苷酸；主要由3个部分组成： ①核心序列，该序列与人工接头的核心序列互补； ②限制性内切酶识别特异序列； ③选择性延伸序列，即引物3′端的选择碱基。 ;AFLP标记技术流程;优点： 可覆盖整个基因组，选择中性。 多态性高、可靠性好、重复性和分别率高。 对DNA模版质量要求高，但用量少，对浓度要求不高，检测效率高。 方便快捷，具有通用性。;缺点;应用;AFLP 工作原理; 影响AFLP实验的因素 ;1.遗传多样性及系统进化中的研究 王志勇等对福建官井大黄鱼野生种???和2个养殖群体用5对选择性引物进行了AFLP分析,共检出503个不同扩增片断(50~450 bp),发现养殖群体的多态片段比例和个体间的遗传差异度均低于野生种群,其遗传多样性水平较低,遗传变异贫乏。 2.亲缘关系鉴定 孙易等利用12对引物检测了15个种及品系的卤虫, 聚类分析结果表明,来自西藏的两性生殖卤虫为不同于中国内陆两性生殖卤虫的新种,内陆和沿海的孤雌生殖卤虫可能为不同的种。 ;3. 构建遗传图谱 Moore等利用AFLP多态位点构建了日本对虾的初步连锁图, 129个标记分布于44个连锁群,覆盖整个基因组的57%左右。 4.基因的定位及分离 Cui等运用cDNA-AFLP技术对红鳍东方鲀成熟和未成熟个体的逆转录DNA进行检测，发现了5个性别标记（TDF1-5）；其中前4个（TDF1-4）来自性腺，第5个（TDF5）来自尾鳍，因此，TDF5就可以用于快速鉴定红鳍东方纯性别，不必对鱼进行解剖。 ;4 SSR;4.1 SSR标记技术原理;微卫星主要以两个核苷酸为重复单元，如（GT)n, (GA)n,(CA)n,(TG)n (AT)n，也有一些重复单元为3核苷酸，少数为4个或更多。 不同遗传材料重复次数的可变性导致了SSR长度的高度变异。 微卫星的突变率在不同物种、同一物种不同位点和同一位点的不同等位基因之间存在很大差异。;检测单一的多等位基因位点，位点具有专化性。 微卫星呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律，可鉴别纯合子和杂合子。 SSR所需DNA量少，DNA降解也可有效分析。 SSR序列的两侧顺序常较保守，在同种而不同遗传型间多相同。 多数SSR无功能作用，在品种间具广泛的位点变异，比RFLP和RAPD分子标记具多态性。; 由于创建新SSR标记需要知道重复序列两端的序列信息，不能直接从DNA数据库查询，需要先对其进行测序。 研发初期困难，开始筛选重复序列和引物涉及过程较慢，费用较高；一旦引物确定，使用较方便结果也稳定。 ;4.3 SSR标记技术的操作;1.杂交优势预测中的应用 微卫星多态性反映着物种的进化历史。现代杂交优势理论认为，杂交优势大小在一定程度上取决于亲本间遗传距离的大小，因此，可以对群体或个体间遗传距离较远的物种进行杂交育种 2.群体的杂合度研究 水产养殖人工繁育计划的一个重要内容是要知道繁育群体的遗传变异的大小,从而制定出科学的管