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HRM建议标准优化流程 LC480 甲基化处理 亚硫酸钠处理强度受很多因素影响，且伴随DNA片段化，因此对样品量操作时间等诸多操作细节有严格限制 建议采用商品化试剂盒进行甲基化处理与后续纯化 例如Qiagen的kit提供DNA保护缓冲液，显著降低了对样品量与操作时间的苛刻限制 样品处理后建议再测一次OD值，HRM的样品浓度值不宜太低 HRM的PCR扩增基本要求 要求Hotstart，最好5min以上HRM往往是大批量样品，PCR加样时间较长Hotstart可以避免长时间加样导致的非特异性PCR扩增问题 饱和荧光染料，最好耐受光淬灭 快速PCR试剂不适合HRM的PCR要求taq酶的PCR扩增性能和保真性能很难同时保证HRM本质是检测突变，因此要尽量避免在PCR扩增过程中引入突变 LC480 HRM Master Mix20/10/5ul反应体系灵敏度15% LC480 HRM Master Mix 10ul或20ul体系都可以，所有体系按比例配制即可 如下 LC480 HRM Master Mix10ul体系 注意该处调为10 Touch down PCR / 触底PCR 突变或甲基化检测很难设计理想的引物 免于实验条件的摸索优化 避免引物二聚体与非特异性扩增的出现 设计引物预期Tm+3度作为起始退火温度，每个循环降低0.5或1度，直至53度 Touch down PCR / 触底PCR循环数增加到50~55cycles（触底PCR及低引物浓度共同决定） Touch down PCR / 触底PCR工作原理 高退火温度时，PCR扩增的特异性好，但效率低 低退火温度时，PCR扩增的效率高，但特异性低 前面几个循环先保证PCR扩增特异性，优先合成较多特异性PCR产物 后面的循环由于特异性模板增多，降低退火温度也有较好特异性 后面几十循环低退火温度，确保高扩增效果 低引物浓度推荐0.2uM，建议0.1~0.3uM 低引物浓度，避免引物二聚体与非特异性扩增 对Mg++浓度等因素的抗干扰能力更强 PCR扩增需要更多循环数，建议50~55cycles 低引物浓度高、低引物浓度条件下的熔解曲线比较 16号DNA 0.5ul引物 0.2ul引物 优化Mg++浓度推荐终浓度3.0mM，即20ul体系加2.4ul 优化Mg ++浓度的模板选择建议选择来自不同方法、批次及质量的模板DNA 推荐选择优化浓度 评价标准：引物二聚体、非特异性扩增、Ct值与扩增曲线形状 HRM的PCR扩增 注意左右2个图中扩增曲线的纵坐标因触底PCR及引物低浓度，不会有明显平台期 HRM的PCR扩增 因触底PCR及引物低浓度，不会有明显平台期HRM Master mix Sybr Green mix LightCycler 480 HRM解决方案 起始条件：LC480 HRM master mix+ 触底PCR+低引物浓度0.2uM或40%正常引物浓度（常规退火温度+3度为起始退火温度，降到53度） 优化Mg++浓度 批量HRM筛查 大批量分子生物学试验的细节 96孔板或八联管存放样品，便于排枪操作 样品进行适当稀释，减少加样误差 Ranin排枪的平行性最佳 注意样品/枪头的摆放位置与秩序 甲基化HRM主要问题及解决 亚硫酸钠处理后得率低 商品化亚硫酸钠处理及纯化试剂盒避免对样品量与操作的严格要求 PCR难以扩增出来 原装LC480 HRM试剂盒+Mg优化+触底PCR 引物设计也有一定影响可设计2-3对引物，并考虑交叉配对 甲基化PCR优化技巧 在引物中引入甲基化位点倾向性扩增甲基化或非甲基化序列，适当提高对甲基化或非甲基化含量的分辨率例如常规条件可检出1%的甲基化，重新设计的引物倾向扩增甲基化序列，那么可检出比例更低至0.1%的甲基化 Cold PCRPCR循环中变性步骤中降低变性温度，使高CG含量的双链DNA分子更少解链从而抑制退火步骤中引物与高CG含量的双链DNA分子的结合进而抑制延伸步骤taq酶对高CG含量的PCR单链DNA分子扩增倾向性扩增低CG含量的模板，检测更低比例的非甲基化 480数据分析 避开二聚体 某些突变分不开？ 与qiagen的区别 Qiagen耗材 实验程序