沈阳药科大学生物化学—— 基因工程.pptxVIP

第 十 四 章 基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering目 录第 一 节DNA的重组DNA RecombinationDNA重组同源重组 (homologous recombination)接合作用 (conjugation)转化作用 (transformation)转导作用 (transduction)位点特异的重组(site-specific recombination)转 座 (transposition)一、同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。片段重组体(patch recombinant)拼接重组体(splice recombinant) Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 5′5′5′ DNA 连接酶分支迁移 (recA)5′5′5′ 内切酶 (recBCD) 内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′3′5′5′5′5′5′3′5′5′3′3′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′5′5′3′3′5′3′5′5′3′5′3′3′3′Holiday中间体目 录内切酶(ruvC)5′ DNA连接酶 DNA连接酶内切酶(ruvC)3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′5′3′5′5′5′5′5′5′3′3′5′3′3′3′3′5′3′3′Holiday中间体5′5′5′3′3′3′3′3′5′5′3′5′3′5′5′5′5′3′3′片段重组体拼接重组体目 录二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子可接合质粒如 F 因子(F factor) （二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。目 录（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。例溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径(lysogenic pathway)λ噬菌体的生活史目 录目 录三、位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。例 （一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素启动序列hin启动序列IDNAH2H1转位片段 H1鞭毛素 阻遏蛋白hinIHin重组酶H1H2沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变L V D J C L V J C 例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。 轻链的基因片段：重链的基因片段：CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC