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原核生物基因的表达调控原核生物的主要转录调控方式原核细胞表达体系与表达载体真核细胞表达体系展示表达技术1. 原核生物基因的表达调控☆（1）染色体DNA特点基因结构简洁有效，无多余序列，必须利用少量的DNA序列充分存储必要的遗传信息（操纵子、重叠基因）一个复制起点（ori），一个复制终点（ter）（2）基因表达特点1种RNA聚合酶，多种σ因子，通过调控σ因子的表达来调控不同种类基因表达 E. coli 有7种 σ70(housekeeping), σH,σE, σS, σN, σF, σFecI 转录与翻译同时进行，无转录后加工，翻译后加工方式简单（酶原）启动子的重要保守区-35、-16、-10区等，RBS序列（SD序列与起始密码子间隔3·9个碱基） （3）基因表达调节特点 调控层次少：酶活调节-转录和翻译调节-总体调控 以转录调控为主，简单而快速（mRNA半衰期比蛋白质短，重新合成RNA在能耗上也比重新合成蛋白质少）☆☆2. 原核生物的主要转录调控方式★主要方式有：诱导、激活、阻遏、弱化、Riboswitch调控（核糖核酸开关）（1）诱导+激活 ：lac操纵子的表达调控Catabolite Repression (also called glucose repression)LactoseGlucoseLactoseGlucosesugar concentrationCell numbersCell numbers葡萄糖乳糖二次生长现象:葡萄糖被优先利用，被基本耗尽时，细胞开始合成有关利用乳糖的酶（生长停滞期），将乳糖运入胞内后继续生长。底物诱导★诱导物乳糖（或异乳糖）缺乏时，lacI编码的阻遏物具有活性，和操纵基因lacO结合后关闭转录，起负调控作用存在诱导物乳糖（或异乳糖）时，诱导物充当辅阻遏物，和阻遏蛋白结合使其失活，转录起始(效率低）,在cAMP-CRP结合在DNA的前提下，高效转录CRP： cyclic AMP Receptor Protein 是乳糖操纵子转录的正调节物（或者CAP)★ 激活葡萄糖浓度高时，细胞内cAMP浓度很低，CRP无法被激活，即使阻遏蛋白LacI失活，操纵子也不能高表达 葡萄糖浓度低造成cAMP的大量生成，从而激活CRP启动转录，起正调控作用★当Trp很少时，由trpR编码的阻遏蛋白没有活性，不能和操纵基因结合，转录可以起始。当Trp大量存在时，阻遏物可以和作为辅阻遏物Trp结合而被激活，然后和操纵基因结合，使转录不能起始。 Trp反馈阻遏的解除使转录强度提高70倍（2）阻遏:Trp 操纵子阻遏（3）弱化:Trp 操纵子转录弱化★前导链RNA二级结构受到氨基酰-tRNA分子的调节： His、Trp、Phe等氨基酸操纵子大肠杆菌色氨酸操纵子 在大肠杆菌色氨酸操纵子中在存在一种转录的弱化调节，弱化作用的解除可使转录强度升高8-10倍。转录的mRNA的5‘端存在一段前导链，通过前导链二级结构的变化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖体的翻译来控制转录是否继续进行前导链的特点：含有一个起始密码子和一个终止密码子含有两个连续的Trp密码子四段能形成不同二级结构的序列，可以形成终止子结构或抗终止子结构(茎环）一旦转录开始后，核糖体结合在前导链上开始翻译，核糖体紧随在RNA聚合酶之后移动。Trp缺乏时，由于大多数色氨酰-tRNA空载，核糖体在两个连续的Trp密码子处暂时停滞或移动变慢，转录出的前导链2、3区配对形成抗终止子结构，mRNA链继续随着RNA聚合酶的移动而延长，直到转录出完整的产物。Trp充足时，大多数色氨酰-tRNA载有Trp ，核糖体快速通过两个连续的Trp密码子并占据前导链2区的一部分，使2、3区不能配对形成抗终止子，而是3、4区配对，刚好形成终止子结构，mRNA链从RNA聚合酶上脱落下来，转录提前终止。（4）Riboswitch★前导链RNA直接感应终端产物的浓度而改变二级结构： THI（B1）-box、RFN （B2） -box和 B12 -box维生素操纵子、嘌呤操纵子等或与其代谢相关的基因，这种调节结构也称为“Riboswitch” (ribonucleotide switch) 可以体外通过对随机RNA序列的筛选得到可以感应特定代谢物浓度的适配体（aptamer），根据该代谢物浓度变化来开关目标基因的表达-35 -103. 原核表达体系★（1）启动子(基本类型2类：组成型和调控型）lac 启动子 最早应用的表达系统，含CRP结合位点及lacO，其转录受CRP正调控和lacI负调控。 lacUV5 启动子 Plac的突变型,能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受l