基因工程第三组核算的提取.pptxVIP

核酸的提取第三组：王诺菡 朱猛 黄伟男 于大伟 刘芳军 马强 张博 熊建云 杨帆 李志宽提纲前言DNA提取DNA提取的原则DNA提取的方法RNA提取RNA提取相关知识RNA提取方法及注意事项DNA 和RNA提取常见问题分析核酸提取方法在不同材料中的改进?前言核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3＇端带有polyA结构。DNA提取DNA提取的原则保证DNA一级结构的完整性 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等DNA纯化要求核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然.DNA提取的方法基因组DNA的提取CTAB法SDS法质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法基因组DNA提取主要方法CTAB法 适用于植物组织，真菌等SDS法 适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等CTAB法(植物DNA提取经典法)原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等 杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。基因组DNA－ CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方组份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ巯基乙醇终浓度100 mM20 mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入TrisHC（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg 2+ 或Mn 2+ 离子抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－ CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β巯基乙醇终浓度100 mM20 mM1.4M2%(W/V)5%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。CTAB法流程图裂解液酒精沉淀植物材料液氮研磨抽提离心洗涤细胞裂解上层溶液干燥溶解DNA溶 液SDS法原理 SDS 阴离子去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；对DNase、RNase有一定的抑制作用。高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNASDS提取缓冲液的配方组份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度100 mM20 mM1.4M2%(W/V)TrisHCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg 2+ 或Mn 2+ 离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；SDS法流程图裂解液酒精沉淀动物组织细胞组织匀浆抽提离心洗涤细胞裂解上层溶液干燥溶解DNA溶 液基因组DNA－其它裂解方法根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解生物方式：酶法基因组DNA纯化的方法吸附材料结合法：吸附材料纯化原理硅质材料高盐低pH值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的质粒DNA提取碱裂解法 煮沸法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢