实验17 动物组织核酸提取与鉴定.pptxVIP

动物组织中DNA的提取与鉴定实验目的 掌握动物组织中DNA提取的原理和操作过程 了解DNA的组分，掌握DNA的定性检测的具体方法 掌握DNA纯度检测和浓度测定方法实验原理—DNA提取 动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液中的溶解度有显著区别。DNA核蛋白在0.14 mol/L 氯化钠中溶解度低，但在1 – 2 mol/L氯化钠中溶解度高；RNA核蛋白在0.14 mol/L氯化钠中溶解度仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取开来。 实验原理—DNA提取氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀，将核酸物质萃取出来；再向萃取液中加入适量乙醇，可使DNA析出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化研究中非常常用，氯仿-异戊醇抽提的原理是，氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA。 实验原理—DNA鉴定DNA是由脱氧核糖核苷酸单体构成，其组成部分包括磷酸、有机碱（嘌呤与嘧啶）、戊糖（脱氧核糖）。 1）磷酸 磷钼酸 钼蓝 （显蓝色）2）嘌呤碱 嘌呤银化合物（灰褐色、絮状）3）脱氧核糖 ω-羟基-γ-酮基戊醛蓝色化合物 钼酸铵 Vc 或 氨基萘酚磺酸硝酸银 二苯胺硫酸 实验试剂 含有0.14 mol/L NaCl的0.015 mol/L柠檬酸钠溶液 1mol/L NaCl溶液 氯仿-异戊醇（24 : 1, V/V） 95%乙醇 氨水溶液 5% AgNO3溶液7.2.5%钼酸铵试剂 （取蒸馏水400 mL，加入浓硫酸83 mL，将钼酸铵25 g溶于其中，最后稀释至1 L，冰箱放置一个月不变质）8. Vc-钼酸铵溶液 （称取还原型抗坏血酸0.53 g溶解于100 mL 2.5%钼酸铵溶液，贮于棕色瓶中，当天配制） 3, 5-二羟基甲苯试剂（取比重1.19的HCl 100mL，加入FeCl3·6H2O 100 mg及二羟甲苯100 mL，混合溶解后，置于棕色瓶中，临用前新鲜配制） 二苯胺试剂（取1 g纯的二苯胺溶于10 mL重蒸馏的冰乙酸中，加入2.75 mL浓硫酸，放置于棕色瓶，临用前新鲜配制）实验仪器电子天平 匀浆器 电炉离心机 紫外分光光度计实验步骤（一）DNA的提取 取新鲜猪肝组织3 g，加入0.14 mol/L NaCl，0.015 mol/L柠檬酸纳溶液6 mL，在乳钵中加入少量石英砂仔细研磨成匀浆，或用组织匀浆器匀浆30 s； 将匀浆倒入离心管，4000 rpm，15 min，弃上清； 沉淀中加入15 mL 1mol/L NaCl，混匀，搅拌数分钟， 4000 rpm，15 min，弃沉淀； 上清转移至另一离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇（24 : 1, V/V），剧烈振摇10 min， 4000 rpm，10 min； 取上层，转移至另一离心管，加入等体积95%乙醇，可见白色丝状沉淀，可用玻棒慢慢缠绕取出沉淀，或4000 rpm，10 min，离心取沉淀（DNA粗品），用1 mL蒸馏水稀释溶解DNA。实验步骤（二）DNA的鉴定 取部分DNA溶液加入试管，加4 mL5%（m/V）H2SO4，再用带有长玻璃管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加入15 min，静置数分钟水解DNA，取上清进行鉴定分析； 取DNA水解液1 mL，加二苯胺试剂2 mL，摇匀于沸水浴中加热10 min，观察颜色变化； 取0.5 mL5% AgNO3溶液，逐滴加入10% 氨水，并使沉淀刚好溶解为宜，然后逐滴加入DNA水解液观察并记录现象； 取0.5 mL DNA水解液，加入Vc-钼酸铵溶液1 mL，摇匀，放置10 min，有何现象？再将溶液加热，又发生什么变化，请解释之。实验步骤（三）DNA的纯度测定与定量 取DNA提取液0.1 mL，用水或缓冲液稀释一定浓度，用紫外分光光度计分别测定同一样品的260 nm和280 nm的吸光值（OD），检测DNA的纯度及浓度。 若A260 nm / A280 nm 接近于1.8，则说明DNA样品的纯度高； DNA浓度（μg/mL） = A260 nm × 50 × 稀释倍数 × （1/光经） DNA得率（mg）= DNA浓度 × 最终DNA原液（mL）思考题1. 记录DNA提取和鉴定过程中的试验现象，结合实验原理进行分析；2. 分析DNA样品的纯度，计算DNA的浓度和得率。谢谢！