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几种常用的染料 Calcein [k?lse?n]：钙黄绿素（活菌染色） Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein(钙黄绿素)不会抑制任何的细胞功能如增殖或淋巴球的趋化性。另外，使用了Calcein(钙黄绿素)的活性检测的实验结果是十分可信并且与标准的51Cr-释放法所得结果相一致的。Calcein(钙黄绿素)的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。 Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein(钙黄绿素)能发出强绿色荧光，因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm），因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein(钙黄绿素)和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein-AM和碘化丙啶（PI）经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。 由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。 PI：碘化丙啶（只对死细胞进行染色，只结合死菌，使死菌无法扩增） 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。 3. PMA（只对死细胞进行染色，只结合死菌，使死菌无法扩增） PMA(propidium monoazide)，叠氮溴化丙锭，PMA?是一款具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料。染料自身的荧光非常微弱， 但是结合核酸后荧光信号很强。PMA 倾向于结合dsDNA，PMA上的叠氮基团生成高反应性的nitrene基，很容易的在结合部位与碳氢化合物部分地结合生成稳定牢固的共价氮碳键，从而形成稳定的DNA修饰。PMA完全不能通透细胞膜，因此它只能选择性的修饰死细胞“暴露”的DNA(细胞壁和细胞膜已破损的细胞)。这一特性使得它可以和定量RT-PCR联合使用，进行选择性的扩增活细胞DNA，不扩增死细胞DNA。例如，许多细菌在不良环境下能进入活的非可培养状态（Viable but nonculturable state, VBNC）。细菌培养技术常常造成VBNC状态的细菌漏检，利用EMA（Ethidium Monoazide Bromide）或者PMA（propidium monoazide）联合PCR技术选择性抑制细菌死细胞扩增，该方法结合了EMA（PMA）选择渗透性和PCR特异性，作为一种区分细胞死活的方法，可以有效检测细菌VBNC细胞。 EMA（只对死细胞进行染色，只结合死菌，使死菌无法扩增） 在食品、药品、水环境、医疗样品等微生物学检验过程中，传统PCR技术无法区分样品中的死菌与活菌，因为死菌DNA在PCR检测中也能扩增出目的基因，从而使检测结果出现大量的假阳性，干扰了检测的真实性。叠氮溴化丙锭（PMA）和叠氮溴乙锭（EMA）是一类新型的核酸结合染料，它们可以穿过受损的细胞膜或死菌细胞膜进入细胞内，与基因组DNA发生共价交联反应，从而能阻止样品中死菌DNA进入PCR扩增环节。而PMA或EMA都不能透过完整未受损的活菌细胞膜，活菌DNA不受其影响，从而让样品中活菌DNA得到PCR扩增。通过这种方法（PMA-qPCR、EMA-qPCR）或其他方法（PMA-LAMP、EMA-LAMP），最终使死菌DNA在检验过程中被选择性的剔除，大大提高了活菌检测的准确性。