专题复习——PCR技术.ppt

* PCR技术 高考专题复习 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。 1988年美国穆里斯（K.Mullis）等人发明，荣获1993年诺贝尔化学奖。 PCR 【基础知识】 一、PCR原理： DNA复制： 半保留复制； 【基础知识】 一、PCR原理： DNA复制： 半保留复制； 需要提供合成模板； 不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3’-OH； 合成的方向都是5’→3’。 DNA聚合酶 【基础知识】 一、PCR原理： DNA复制： 半保留复制； DNA的热变性原理。 Taq DNA聚合酶 耐高温。 【基础知识】 二、PCR条件： 胞内DNA复制与PCR技术的比较： Mg2+,缓冲对 缓冲液 DNA母链 模板 半不连续复制 子链合成 最适温度 温度 dNTP 能量+原料 RNA 引物 解旋酶/DNA聚合酶/DNA连接酶/引物酶 酶 解旋酶，边解旋边复制 解旋 PCR 胞内DNA复制 变性 Taq DNA聚合酶 DNA母链 dNTP 3个温度 Mg2+,缓冲对 连续复制 DNA 【基础知识】 二、PCR条件： 引物： 利用软件设计。 引物设计的原则： 决定PCR扩增产物的特异性和长度。 1.引物长度： 通常为20～30bp，尽量降低引物与非扩增区的同源性； 2.引物内部不能存在部分互补序列； 3.两个引物之间不能存在部分互补序列； 4.引物的5’端可以修饰，但3’端不可以修饰： 如探针标记。 例题 1 【2011年安徽】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。 采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、 和 。 对干扰素基因特异的DNA引物对 Taq DNA聚合酶 例题 2 【2011年江苏】请回答基因工程方面的有关问题： （1）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。 ①第一组： ； ②第二组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 （2）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。 DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上 【基础知识】 二、PCR条件： 温度： 70℃～75℃： 90℃～95℃： 55℃～60℃： 变性； 复性； 延伸。 【注意】 具体温度与DNA母链及引物中的G、C含量有关。 例题 3 【2008年江苏】回答下列问题。 （1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。 （2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？ 。 耐高温 引物对B 【基础知识】 三、PCR过程： 预变性； 复性； 延伸； 循环。 变性； 【2011年江苏】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 （1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为 。 （2）在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 15/16 三 例题 4 【实验操作】 一、实验仪器： 二、设置对照： 【实验操作】 三、程序设计： 避免外源DNA的污染。 【实验操作】 微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌； 微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头； 所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，离心10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。 四、操作提示： * * *