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2.3 样品的预处理与检测 样品来源的形式 1 可直接进样的溶液（注意是否与流动相匹配） 2 需稀释、pH缓冲、加内标或其它操作 3 固体样品－选择合适的溶剂 4 需提取分离的样品 5 预处理，除去干扰物尤其对仪器和柱子有损害的物质。 总之，将样品溶于合适的溶液；或者用合适的溶液提取出来、或者分离处理对测定有干扰的物质，在处理中应注意被测组分的稳定性和提取率。 2.4 HPLC分析模式 按照样品的特性分为以下二类： A 一般样品（2000DW） 可采用基本标准的方法。 （中性的、离子的）－反相、离子对、非水反相、正相、离子交换。 B 特殊样品 无机离子、异构体、对映体、生物样品、肽类、核苷酸、大分子、蛋白质、核酸、糖类，合成聚合物。 2.5 色谱条件 色谱条件主要包括以下几个方面： 流动相的组成及流速、温度等。 色谱柱的类型 样品处理方法 检测器的确定和参数 数据处理 方法的稳定性及其它 2.6 方法的优化，及色谱现象的解析和处理 优化包括合理缩短分析时间、提高灵敏度、分离度，成本优化，方法的稳定性， 对出现的各种色谱现象，包括仪器和样品的稳定性等提出切实可行的办法。 建立合理的数据处理方法等。 2.7 定性和定量方法的建立及论证 对方法的检测限、灵敏度、定量重复性、偏差、回收率、样品的稳定性、方法的稳定性、线性关系等求证。建立可靠的稳定的分析方法。 3 色谱条件的选择 3.1 流动相的选择 3.1.1 流动相的试剂类型 以常见的HPLC为例，正相、反向、离子对。 正相的试剂有正己烷、环已烷、正庚烷、戊烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氧六圜，也可加一些极性试剂如乙酸、乙醇、异丙醇、四氢呋喃等 注意：这些有机试剂的纯度非常重要，一是含水的问题，（水的含量将影响保留时间，重复性差）二是其中芳香环杂质对紫外检测的干扰，国产分析纯的试剂一般质量很差，不能直接用于低波长的紫外检测，需重新处理（用硅胶柱过滤其杂质）。最好采用色谱纯的试剂，但成本很高。 检测池清洗 故障：样品池受污 表现：样品池和参比池能量相差较大 检查方法：设定250 nm波长，通甲醇或水，查看SMPLEN 和REF EN，如两者相差较大，则样品池受污 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中清洗。 基线噪声：三种情况引起 a、氘灯寿命。氘灯寿命到了时，基线不稳定有噪声产生。氘灯发射出的光的强度不稳定，就象日光灯寿命终止时亮度在不断变化。计算一下使用的时间或看一下计时器即可判断。现象：基线呈或上或下的无规则变化。 b、检测池内有气泡。流动相流动时，引起微小气泡的抖动，光强随着变化（气体与流动相对波长的吸收度不同）。排除方法：将池子液体出口处用吸耳球的任何部位堵住，此时，压力显示会增加一点，气泡被压缩很小很小，然后突然松开，气泡会突然膨胀随液体流出，反复多次即可排除。 c、池子内污染。有微小的颗粒随流动相的流动在晃动，引起吸收值的变化。检查方法：取下池子，用吸耳球吹净池内的液体，在阳光下观察池内情况，必要时拆开清洗。污染物的来源大致是样品长期累积、柱填料流出等。  以上三种情况可以这样进行判断：泵停止运转，分别观察参比值 R、测量值S的稳定性，方法是分别按下参比键、测量键不动，显示值在变化（R值和S值），可以判断氘灯是否有问题，寿命是否终止期到了。如果R值很稳定，S值不稳定（此时泵正常运转）则判断池体内有气泡或污染。 基线漂移 a、溶解在流动相中的气体在池体内突然减压，产生气泡（微小）逐渐增大，逐渐使吸收度改变引起漂移。排除方法同上述b。 b、 环境温度变化较大，使仪器内的温度随之变化，电力工作点改变引起漂移。流动相、柱子随温度的变化也会引起漂移。应尽量减小温度的变化。 c、 柱子长期大量不断的进样品，有些比较重的组份会慢慢不断的溜出，形成漂移，这时候需要对柱子进行清洗。流动相中加入缓冲液时，用完后冲洗不彻底，再开机时也会出现基线漂移的现象。  检测器不能正常调零 a、检测器本身电路故障，如氘灯不启辉，调零键开关接触不上均可出现调零故障（外接调零试一下是否正常调零）。 b、池体污染严重，如石英片内外污物遮挡，使透过率大大降低，S值很小，调零电路无法进行工作。 c、流动相本身的质量问题，缓冲液配错成份均能引起S值的改变（举例） d、氘灯寿命，能量降低、S值下降等引起不调零。但是绝大多数情况是基线不稳定。 UV和DAD有什么区别 UV单波长检测器是先经光栅分光，然后分两束，一路经流通池由样品吸收后到光电池检测，另一路直接到光电池。DAD时光源直接到流通池，然后分光后到二极管阵列。紫外检测通常三个指标，噪音漂移及波长准确性比较可以发现，单波长的光分成了两路，强度变弱，