DNA提取的注意事项.docxVIP

基因组 DNA 提取 DNA 是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验，获得高分子量和高 纯度的基因组 DNA 是非常重要的前提，因此基因组 DNA 的提取也是分子生物 学试验技术中最重要、最基本的操作之一。 一、基因组 DNA 提取的原则 保证核酸一级结构的完整性(因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故 完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基层)。 排除其它分子(如蛋白质、多糖,、脂类、有机溶剂等)的污染，使下游试验顺 利进行。 二、基因组 DNA 提取的原理和方法 DNA 与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染 色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。 从组织中提取 DNA 必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使 染色体释放出来，同时去除与 DNA 结合的组蛋白及非组蛋白。 1、样品预处理 从各种不同来源的样品(如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等)中提取高纯 度的基因组 DNA，因细胞结构及所成分不同，样品预处理方式也不同，以下简 单介绍常用提取材料的预处理方式，若需详细了解，请参考本公司各基因组 DNA 提取试剂盒说明书。 部分样品预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物材料匀浆、液氮研磨 培养细胞蛋白酶 K 处理 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨 血液红细胞裂解液去红细胞 2、细胞裂解 CTAB 法： 适用于植物组织、真菌等。 CTAB 是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物 在高盐溶液中(0.7M NaCl)是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、 多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 SDS 法： 适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。 SDS 是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体 解析。 其它裂解方法： 物理方式：机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等 化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解等 酶法：蛋白酶 K 3、DNA 分离纯化 纯化要求： 核酸样品中不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA 聚合酶等)有抑制作用的成分。 其它生物大分子如蛋白质、多糖、多酚和脂类分子等污染应降低到最低程度。 排除其它核酸分子的污染，如提 DNA 时应去除 RNA，反之亦然。 纯化方法： 细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化 DNA，主要有硅基质材 料、阴离子交换树脂和磁珠等。因硅基质材料可特异吸附核酸 DNA，使用方便、 快捷，不需要使用有毒溶剂如酚、氯仿等，使得提取基因组像过滤一样简单， 因此硅基质材料成为大规模分离纯化 DNA 的通用方法。 硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用 DNA 在高盐低 pH 值环境下与硅基质材 料相结合，在低盐高 pH 值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高 浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化 的硅石破坏了基质和 DNA 之间的吸引力，因而 DNA 从硅基质上被洗脱下来。 注意事项： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。 减少化学物质对 DNA 的降解，为避免过酸、过碱对 DNA 双链中磷酸二酯键的 破坏，操作多在 pH 值 4.0-10.0 的条件下进行。 防止基因组 DNA 的生物降解，主要是 DNase 降解基因组 DNA，DNase 需二 价金属阳离子如 Mg2+等的激活，可用 EDTA 等金属离子螯和剂螯和 Mg2+以 抑制 DNase 的活性。 减少物理因素对 DNA 的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈振荡、 搅拌等)，细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂，DNase 大量释放， 样品反复冻融和高温等。 4、DNA 洗脱收集 DNA 的洗脱效率取决于以下重要因素： 洗脱液成分： 采用硅基质膜吸附的 DNA，可将 DNA 在低盐高 pH 值条件下洗脱下来。pH 值 在 7.0-8.5 之间洗脱效率较高，pH 值低于 7.0 则洗脱效率很低。一般基因组提 取试剂盒中的洗脱缓冲液就是 TE(pH8.0)，既为 DNA 从硅基质膜上洗脱下来提 供良好的 pH 环境，其中的 EDTA 又能保证 DNA 不被 DNase 降解，同时由于 EDTA 浓度非常低，对核酸内切酶、DNA 聚合酶的影响非常微弱，不影响后续 试验，可放心使用。 洗脱液体积： 当洗脱液体积小于 30ul 时，洗脱效率很低且不稳定；当洗脱液体积在 50-200ul 时，洗脱效率稳定在 80-90﹪，并可保证得到最大产量，因此洗脱液体积不能 小于 30ul。 加洗脱液部位： 100-200ul 洗脱液能完全覆盖硅基质膜，DNA 的洗