CD19-CAR-T细胞制备工艺.doc

作业指导书 深圳精准医疗科技有限公司 文件编码： 第 PAGE 2页 共 NUMPAGES 6页 受控印章 未经允许不得复印 作业指导书 深圳精准医疗科技有限公司 受控印章 文件名称 文件编码 页 数 第 PAGE 1页 共6页 起草人 起草日期 年 月 日 颁发部门 质量管理部 审核人 审核日期 年 月 日 颁发日期 年 月 日 会签人 批准人 批准日期 年 月 日 生效日期 年 月 日 分发部门 研发部、市场部、质量管理部 未经允许不得复印 CD19-CAR-T细胞制备工艺规程 目的：制备符合规定、合格的CD19-CAR-T细胞 范围： 职责： 技术人：负责按本工艺规程进行细胞制备 实验室主管：负责本工艺规程的执行。 质量部：负责细胞制备全过程的监督和管理。 内容： 产品名称、剂型、规格： 产品名称： CD19-CAR-T 产品剂型： 规格：100mL 性状： 液体 存储条件及效期： 内包装： 产品的质量标准：详见《XXX细胞质量标准》 仪器、设备一览表： 序号 仪器设备 性能要求 序号 仪器设备 性能要求 1 洁净工作台/生物安全柜 A级 8 条码打印机 2 二氧化碳培养箱 9 医用40C冰箱 3 普通离心机 10 超低温冰箱 4 掌上离心机 11 热合机 5 倒置显微镜 12 水浴锅 6 可调式移液器（移液枪） 13 细胞计数仪 7 电动辅助移液器 14 试剂一览表： 序号 试剂名称 规格 1 细胞培养基 1L/瓶 2 细胞因子A 1ug/uL 3 细胞因子B 106 IU/mL 4 淋巴细胞分离液 500mL/瓶 6 转染增效剂 8ug/mL 7 生理盐水 500mL/瓶 8 CD19-CAR-T慢病毒上清 10mL/支 耗材一览表： 序号 耗材 规格 1 细胞培养板 24孔板 6孔板 2 细胞培养瓶 T25 T75 T175 3 培养袋 2L/个 4 离心管 15mL 50mL 250mL 5 移液管 5mL 10mL 25mL 6 细胞滤网 100目/个 7 输液袋 100mL 8 巴氏吸管 3mL/5mL 9 EP管 1.5mL 试剂的配制： 培养基：将1支106 IU的细胞因子B溶于1L培养基，配成完全培养基1。取40mL完全培养基1，加入2uL细胞因子A，配成完全培养基2。 细胞制备工序要求： 工序 操作间 洁净级别 设备名称 洁净级别 细胞制备 制备室 C级 洁净工作台/生物安全柜 A级 细胞培养 培养室 C级 CO2培养箱 C级 细胞收集 制备室 C级 洁净工作台/生物安全柜 A级 细胞制备流程图 细胞制备： 第0天： 第0天 外周血交接 技术员检查： 存放血液的容器是否完好并密封； 标识是否清晰完整并正确； 血液是否结块，是否有溶血； 血液量是否与标识一致。 检查确认合格后，填写《标本采集交接记录》，双人签名确认。 接收外周血，并用75%酒精擦拭消毒2遍，移入制备区。 制备前准备 淋巴细胞分离液和培养基恢复至室温。 准备好若干50mL离心管和24孔培养板。 单个核细胞的分离提取 取出500uL全血置于一干净的1.5mL EP管中，用于血液三分类和流式检测。 将外周血用生理盐水按1:1体积比稀释。 加入15mL淋巴细胞分离液至50mL离心管管底，用25mL移液管将35mL血细胞小心缓慢铺在淋巴细胞分离液上（电动移液器吹液速度为零）。 1800rpm,20 min 常温离心，离心机升6降3。 小心移去生理盐水层，吸取白膜层至50mL离心管，补加生理盐水至离心管满体积,500g，5min 常温离心。 倒去上清，加入生理盐水,重悬细胞，常温离心。洗2-3遍。 用完全培养基2重悬细胞，计数。 T细胞 重悬和诱导活化 按3×106个细胞/mL/well铺在24孔板上。 将24孔置于二氧化碳培养箱中（37℃，5%二氧化碳）培养。 清场 将被血液污染的耗材弃置在生物安全垃圾袋中。 完全培养基1和2配制完后4度保存。 注意事项 第1天（细胞培养24小时）： 第1天 带CD19-CAR慢病毒上清转染T细胞 1、将24孔板的细胞收集，用生理盐水洗涤两次，500g,5min常温离心。 2、用带CD19-CAR慢病毒上清重悬细胞，计数，并用病毒上清稀释至终浓度3×106个细胞/mL，加入总体积千分之一体积的转染增效剂。 3、1000g，离心，2h。 4、在二氧化碳培养箱培养8小时后每个24孔板的孔补加500uL完全培养基1。 注意事项 第3天（转瓶、补液） 第3天 转瓶、补液 1、将24孔板的细胞转入T75的细胞培养瓶，并补充等倍体积的完全培养基1进T75的细胞培养瓶。 注意事项 第5天（转袋、补液）： 第5天 CD19-CAR-T细胞转袋补液 补充完全