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作业指导书
深圳精准医疗科技有限公司
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受控印章
未经允许不得复印
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第 PAGE 1页 共6页
起草人
起草日期
年 月 日
颁发部门
质量管理部
审核人
审核日期
年 月 日
颁发日期
年 月 日
会签人
批准人
批准日期
年 月 日
生效日期
年 月 日
分发部门
研发部、市场部、质量管理部
未经允许不得复印
CD19-CAR-T细胞制备工艺规程
目的:制备符合规定、合格的CD19-CAR-T细胞
范围:
职责:
技术人:负责按本工艺规程进行细胞制备
实验室主管:负责本工艺规程的执行。
质量部:负责细胞制备全过程的监督和管理。
内容:
产品名称、剂型、规格:
产品名称: CD19-CAR-T
产品剂型:
规格:100mL
性状: 液体
存储条件及效期:
内包装:
产品的质量标准:详见《XXX细胞质量标准》
仪器、设备一览表:
序号
仪器设备
性能要求
序号
仪器设备
性能要求
1
洁净工作台/生物安全柜
A级
8
条码打印机
2
二氧化碳培养箱
9
医用40C冰箱
3
普通离心机
10
超低温冰箱
4
掌上离心机
11
热合机
5
倒置显微镜
12
水浴锅
6
可调式移液器(移液枪)
13
细胞计数仪
7
电动辅助移液器
14
试剂一览表:
序号
试剂名称
规格
1
细胞培养基
1L/瓶
2
细胞因子A
1ug/uL
3
细胞因子B
106 IU/mL
4
淋巴细胞分离液
500mL/瓶
6
转染增效剂
8ug/mL
7
生理盐水
500mL/瓶
8
CD19-CAR-T慢病毒上清
10mL/支
耗材一览表:
序号
耗材
规格
1
细胞培养板
24孔板
6孔板
2
细胞培养瓶
T25
T75
T175
3
培养袋
2L/个
4
离心管
15mL
50mL
250mL
5
移液管
5mL
10mL
25mL
6
细胞滤网
100目/个
7
输液袋
100mL
8
巴氏吸管
3mL/5mL
9
EP管
1.5mL
试剂的配制:
培养基:将1支106 IU的细胞因子B溶于1L培养基,配成完全培养基1。取40mL完全培养基1,加入2uL细胞因子A,配成完全培养基2。
细胞制备工序要求:
工序
操作间
洁净级别
设备名称
洁净级别
细胞制备
制备室
C级
洁净工作台/生物安全柜
A级
细胞培养
培养室
C级
CO2培养箱
C级
细胞收集
制备室
C级
洁净工作台/生物安全柜
A级
细胞制备流程图
细胞制备:
第0天:
第0天
外周血交接
技术员检查:
存放血液的容器是否完好并密封;
标识是否清晰完整并正确;
血液是否结块,是否有溶血;
血液量是否与标识一致。
检查确认合格后,填写《标本采集交接记录》,双人签名确认。
接收外周血,并用75%酒精擦拭消毒2遍,移入制备区。
制备前准备
淋巴细胞分离液和培养基恢复至室温。
准备好若干50mL离心管和24孔培养板。
单个核细胞的分离提取
取出500uL全血置于一干净的1.5mL EP管中,用于血液三分类和流式检测。
将外周血用生理盐水按1:1体积比稀释。
加入15mL淋巴细胞分离液至50mL离心管管底,用25mL移液管将35mL血细胞小心缓慢铺在淋巴细胞分离液上(电动移液器吹液速度为零)。
1800rpm,20 min 常温离心,离心机升6降3。
小心移去生理盐水层,吸取白膜层至50mL离心管,补加生理盐水至离心管满体积,500g,5min 常温离心。
倒去上清,加入生理盐水,重悬细胞,常温离心。洗2-3遍。
用完全培养基2重悬细胞,计数。
T细胞
重悬和诱导活化
按3×106个细胞/mL/well铺在24孔板上。
将24孔置于二氧化碳培养箱中(37℃,5%二氧化碳)培养。
清场
将被血液污染的耗材弃置在生物安全垃圾袋中。
完全培养基1和2配制完后4度保存。
注意事项
第1天(细胞培养24小时):
第1天
带CD19-CAR慢病毒上清转染T细胞
1、将24孔板的细胞收集,用生理盐水洗涤两次,500g,5min常温离心。
2、用带CD19-CAR慢病毒上清重悬细胞,计数,并用病毒上清稀释至终浓度3×106个细胞/mL,加入总体积千分之一体积的转染增效剂。
3、1000g,离心,2h。
4、在二氧化碳培养箱培养8小时后每个24孔板的孔补加500uL完全培养基1。
注意事项
第3天(转瓶、补液)
第3天
转瓶、补液
1、将24孔板的细胞转入T75的细胞培养瓶,并补充等倍体积的完全培养基1进T75的细胞培养瓶。
注意事项
第5天(转袋、补液):
第5天
CD19-CAR-T细胞转袋补液
补充完全
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