综合性实验一 质粒DNA小量制备和电泳鉴定.pptVIP

综合性实验二 质粒DNA小量制备和电泳鉴定;一．实验目的;质粒 plasmid;;质粒的特性： 能独立自主进行复制。 细菌内的共生型遗传因子，能垂直遗传。 能赋予宿主细胞一些表型。;质粒的应用;大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。;Visualization of topoisomers. In this experiment, all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the degree of supercoiling. Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules, they migrate more rapidly during gel electrophoresis.;琼脂糖凝胶电泳;■ 影响电泳迁移率的因素：;琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术;;二．实验原理;质粒提取原理;质粒DNA和基因组DNA的区别; 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的有： ? 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点选择。 ? 碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 ;碱裂解法提取质粒的原理;原理： 1. 强碱NaOH和SDS裂解细菌，细菌中的质粒DNA和基因组DNA在强碱条件下发生变性。 2. 怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，而染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。 3. 怎样去除蛋白质？ 留有质粒DNA的上清，经酚/氯仿去除蛋白质后，用乙醇沉淀DNA，即得到质粒DNA。;三、试剂与仪器;四、操作步骤;Resuspension Buffer 细胞悬浮液;2. 质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳;2) 按水平板的长×宽×0.5cm胶厚，量取1×TAE，并按0.8％的浓度称取琼脂糖（agarose），在微波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。;3) 等凝胶温度降至大约50－60℃以下时，加入1 mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/mL ；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡。;6) 上样Buffer 和DNA 混匀后点样，记录点样次序。 7) 在水平板两边的点样孔中分别加入marker即分子量标记。 8) 盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（≤5V/cm）及电泳方向(DNA阴极阳极），开始电泳。 9) 当色素接近胶的尾端，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像。 ;五、结果;