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转录组的研究技术方法及当前进展郑忠巧生物工程一么是转录组？广义转录组（Transcriptome）系指从一种细胞或者组织的基因组所转录出来的RNA的总和，包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA（rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA,microRNA 和其他非编码RNA等）。狭义转录组系指所有参与翻译蛋白质的mRNA 总和。为什么研究转录组？转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的纽带，转录水平的调控是最重要也是目前研究最广泛的生物体调控方式。转录组的研究比基因组的研究能给出?更高效的有用信息。比如，人类基因组包含有30亿个碱基对，其中大约只有5万个基因转录成mRNA分子，而转录后的mRNA仅部分被翻译生成功能性的蛋白?质。与基因组不同，转录组更有时间空间性。比如，?我们人体大部分细胞具有一模一样的基因，?而即使同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况也是不完全相同的。所以，除了异常的mRNA降解现象（如转录衰减）以外，转录组反映的是特?定条件下活跃表达的基因。??研究转录组的基本方法目前研究转录组的方法主要有:（1）基于杂交技术，如cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片；（2）基于测序技术，如早先给予Sanger测序的SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)和MPSS(Massively Parallel Signature Sequencing),全长cDNA文库和EST文库的测序分析.现在对cDNA、EST等的测序工作已升级为代测序技术，第一代测序技术较Sanger测序技术通量更高，运行时间更短，测序片段更长；（3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序，现在通常将基于第二代测序技术的转录组测序分析称为RNA-Seq。转录组的各个研究方法的特点（1）基于杂交技术的特点基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序列，却无法捕获新的mRNA。细胞中mRNA的表达丰度不尽相同，通常细胞中约有不到100种的高丰度mRNA，其总量占总mRNA一半左右，另一半mRNA由种类繁多的低丰度mRNA组成。因此由于杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA表达水平的微小变化（2）SAGE法的特点SAGE是以Sanger测序为基础用来分析基因群体表达状态的一项技术。SAGE?技术首先是提取实验样品中RNA并反转录成cDNA，随后用锚定酶(Anchoring?enzyme)切割双链cDNA，接着将切割的cDNA?片段与不同的接头连接，通过标签酶酶切处理并获得得到SAGE?标签，然后PCR?扩增连接SAGE?标签形成的标签二聚体，最后通过锚定酶切除接头序列，以形成标签二聚体的多聚体并对其测序. SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因表达水平。在差异表达谱的研究中，SAGE可以获得完整的转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、作用机制和通路等。(3)MPSS法的特点MPSS是SAGE的改进版，MPSS?技术首先是提取实验样品RNA并反转录为cDNA，接着将获得的cDNA克隆至具有各种adaptor?的载体库中，并PCR?扩增克隆至载体库中?的不同cDNA?片段，然后在T4?DNA?聚合酶和dGTP?的作用下将PCR产物转换为单链文库，最后通过杂交将其结合在带有Anti-adaptor?的微载体上进行测序。MPSS?技术对于功能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或组织内全部基因的表达特征。MPSS技术对于鉴定致病基因并揭示该基因在疾病中的作用机制等发挥了重要作用(4）高通量测序技术的特点SAGE及MPSS技术的低通量模式切换至RNA-seq的高通量模式。作为蛋白质组研究的基础，RNA-seq可以识别比蛋白组高一两个数量级的基因，从而帮助科学家构建完整的基因表达谱以及蛋白质相互作用网络。RNA-seq对于真核生物的基因表达调控，癌症等疾病的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面的研究具有不可估量的潜力。RNA-seq的特点及应用二代测序在转录组的研究上越来越普 遍, 大有替代先前的基因芯片(microarrays)和基因表 达系列分析技术(serial analysis of gene expression, SAGE)之趋势。由于测序深度的优势, RNA-seq更 能全面地揭示生物个体在特定时刻和特定组织的全 局基因表达情况, 如发现新的转录本、了解基 因表达量、挖掘单核苷酸的多态(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)、选择性剪接(alternative splicing)和结构性变异(structural variation)。对于 序列信息有限的非模式生物,