免疫分析法PPT课件2.pptx

免疫分析法;第一节 概 述;一、基本概念 抗原(antigen, Ag) 是一类能诱导免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答的产物(抗体或效应细胞)发生特异性结合的物质。抗原具有免疫原性和反应原性两种性质。 ;抗体： (antibody ， Ab) 机体是在抗原物质的刺激下形成的一类能与抗原特异性结合的活性球蛋白，又称免疫球蛋白 (immunoglobin ， Ig) ，由细胞合成并分泌。抗体是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具有各种免疫功能，主要存在于动物的血清、淋巴液、组织液及其它外分泌液中。 ; IgG分子由四条以二硫键相连的多肽链构成，有三个功能区。抗体在Fab区结合抗原分子，同时通过hi区的转动以适应不同距离的抗原决定簇。与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上的活性位点，从而表现出固定和激活补体以及粘结单核细胞等亲细胞反应的功能。;抗原-抗体反应 (antigen-antibody reaction)  抗原和对应抗体在一定条件下特异结合形成可逆性抗原-抗体复合物的过程。抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与发生的。;抗原抗体反应的基本类型 ;二、抗原-抗体反应的特点; 在实验条件下，抗原-抗体的反应常会受到结构相近似的其它药物或化合物的干扰，影响待测药物（抗原）与抗体的结合。这种干扰物与抗体的结合称为交叉反应（cross reaction）。交叉反应进行的程度越大，则免疫分析产生的误差也越大。 ; 抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合，它仅发生在分子的表面，并依靠抗原-抗体分子间的静电力作用、疏水作用、氢键作用及范德华引力等而存在。这种结合具有相对稳定性，但仍为可逆反应。 ;3. 最适比例性;三、免疫分析方法产生的背景; 免疫分析基于抗体与药物结合时所具有的专一性和可饱和性，利用被测药物同标记药物之间竞争抗体结合原理，建立药物浓度和响应值（如RIA中的放射性强度）之间的函数关系，用于体内药物分析。; 抗体（Ab）、标记抗原（标记药物，Ag*）和非标记抗原（非标记药物，Ag）三种试剂是所有免疫分析必需的基本试剂，也是任何免疫分析试剂盒应提供的试剂。;三种试剂的作用分别是： 1. 抗体是作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白； 2. 标记药物提供可检测的信号（响应值）； 3. 非标记药物在标准曲线制备时??药物标准品，在样品中则为被测药物。它用于建立被测药物量（浓度）与响应值之间的函数关系，是样品中药物浓度计算的依据。;K2;;抗原-抗体反应时，须满足以下条件： 1. Ag*与Ag（待测物）必须是相同的生物活性物质； 2. 所加入Ag*和Ab的量应是固定的； 3. Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点； 4. Ag*、Ag及Ab须处在同一反应体系中。 ; 标记抗原一抗体的结合率（B％）随着未标记抗原量（待测物）的增加而减少（呈负相关）。这种现象称作竞争抑制作用，即未标记抗原量的增加抑制了标记抗原与抗体的竞争性结合。; 显然，在抗原抗体反应中，标记抗原-抗体结合物减少的程度取决于未标记抗原（被测物）的量，被测物的量越大，标记抗原与抗体的结合率就越小。这种竞争性抑制的数量关系就成为免疫分析的定量基础。;（二）竞争抑制曲线 （或称剂量反应曲线）;;三、基本条件; 免疫原性（Immunogenicity）是指抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体。 ;全抗原： 指同时具有免疫原性和抗原特异性的物质。 作为全抗原的物质其分子量必须足够大（分子量1000），且要求化学结构较复杂，如蛋白质、多肽等。;半抗原（Hapten）：指只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质。;2. 人工抗原的制备 ;（2）半抗原的选择 ;（3）载体与半抗原的结合;①碳二亚胺法 该法是利用碳二亚胺作为缩合剂，将药物分子中的羧基与蛋白质分子的氨基相连形成肽键 ;②混合酸酐法 该法是利用氯甲酸异丁酯为缩合剂，首先氯甲酸异丁酯在碱性（三正丁胺)条件下同含羧基的药物生成混合酸酐，然后再与蛋白质上的氨基缩合，形成肽键。 ;③戊二醛法 该法是利用戊二醛的两个活性基团可使半抗原分子中的氨基与蛋白质分子上的氨基以共价键结合，并在四氢硼钠的条件下进一步生成完全抗原 ;④琥珀酸酐法 该法是利用琥珀酸酐在无水吡啶中与半抗原分子中的羟基反应，首先生成带有羧基的半抗原琥珀酸衍生物，然后再与蛋白质的氨基结合，形