各种酶切位点的保护碱基(引物设计必看).docxVIP

32 各种酶切位点的保护碱基 酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出 3 个 碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加 3 个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列 的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接 头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶， 则通常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用 γ-[ P]ATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A  260 单位的寡核苷酸。取 1 μg 已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20°C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时。反应缓 冲液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCl（视酶的具体要 求而定）。20%的 PAGE（7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷