土壤中芽孢杆菌的分离与筛选.docxVIP

实验十、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选 ——培养基配制及样品采集 一、实验目的 学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽孢杆菌筛选的特 异性培养基配制方法。 二、实验原理 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水 果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最 多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。 从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土 壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同， 在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。 因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三　实验材料 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH 试纸、 记号笔等。 筛选培养基：肉汤琼脂培养基 四、操作步骤 1. 采样： 用取样铲，将表层 5cm 左右的浮土除去，取 5～25cm 处的土样 10～25g， 装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。 北方的干燥土壤，可在 10～30cm 处取样。给牛皮纸袋编号并记录地点、土壤 质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微 生物死亡。 （注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足， 且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其 适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰 1 富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 从土层的纵剖面看，1～5cm 的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少， 且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比 5～25cm 土层少；25cm 以下土层 则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采 土样最好的土层是 5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且 各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆 菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约 5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。） 2．筛选培养基配制： 筛选培养基配方（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，氯化钠 5，琼脂粉 15，pH 7.5。每 500ml 三角瓶装 200ml 培养基，121℃灭菌 20min，备用。 3．无菌水制备 250ml 三角瓶，加入 50 ml 蒸馏水，玻璃珠 8 颗，透气塞及牛皮纸（或报 纸）封口，灭菌后备用。 试管 10 支，装 9ml/支蒸馏水，透气塞及牛皮纸（或报纸）封口，灭菌后备 用。 培养皿包封，灭菌后备用。 1ml 吸管若干，棉花封口，报纸包扎后灭菌，备用。 涂布棒包扎后灭菌，备用。 五、思考题 1．你认为自然界中哪些地点更容易采集和分离到本试验的目标菌株？ 实验十一、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选 ——样品处理及初筛 一、实验目的 学习从自然界中采集的样品中进行菌种分离的技术，掌握稀释涂布平板方法 进行芽孢菌初筛的技术。 二、实验原理 2 － －3 －5 菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技 术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们 进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening） 虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作 用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的 菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。 枯草芽孢杆菌在自然界中分布很广，在很多的环境中经常能够找到。由于 其体内能够产生芽孢，能抗高热，所以，获得样品时可先加热，将其他非耐热 的微生物杀死得以富集。 三、实验材料 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。 试剂：芽孢染色液。 其他器具：超净工作台、显微镜、培养皿、水浴锅；涂布棒、三角瓶、接 种环、酒精灯等。 四、操作步骤 1．样品稀释： 称取土样 10g，加入到备好的玻璃珠和无菌水（90ml）的三角瓶内，振摇 5 min。按微生物稀释法操作，稀释到稀释到 10 ～10 稀释度。 2．加热处理： 取最后三支土样稀释液，置于 100℃水浴中 3～5 分钟后，灭活营养细胞， 保留芽孢。 3．涂布平板和培养： 培养基倒平板，凝固后，处理好的三个稀释度的样品各取 0.1ml 涂布平板， 30℃倒置培养 24h 以上。 4．形态观察 进行单染色或者芽孢染色方法，观察你分理出的细菌的芽孢产生情况。 五、思考题 1．你认为还有哪些方法对样品进行预先处理，有益于本试验目标菌株的获得？ 3 4