分子生物学常用技术及其的应用.pptVIP

1、置换λ载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。 2、插入λ载体 – 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。 裂解途径 （三）.粘粒(cosmid vector)（30～40kb） 是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid –而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装30～45kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。 (四) 大片段DNA克隆载体 人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。 1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC） 优点：能携带大片段DNA，约300kb。 在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。 缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A, part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。 2、噬菌体PI载体和PAC PI噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110～115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。 1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-----PAC。 3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC） 适用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb YAC 的主要功能成份有三： 1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。 三、DNA重组与分子克隆化 为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。 基本原理与过程： 　1、分离纯化目的基因 　2、目的基因 + vector =重组DNA分子 　3、重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。 　4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone），将转化的细胞置于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 　5、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。 分离纯化目的基因目的基因 + vector =重组DNA分子 重组　　DNA 和 分子 克隆 重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源） 　1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 　2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 　3、化学合成目的基因进行克隆 　4、PCR体外扩增目的片段进行克隆 从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆（cell clone） 筛查含有目的基因的细胞克隆 四、目的基因表达 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。 重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。 就是将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。（expression cloning）. 目的基因表达 （一）真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达  原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆 菌为宿主。 真核多肽的表达要求： 1）适当的cDNA（完整的编码序列）； 2）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。? 产物特征： 1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 2）活性受限或无活性。 (二) 真核细胞基因在真核细胞中表达 真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作