引物设计原则及酶切位点选择和设计.docxVIP

对片断进行酶切分析 对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用 引物设计原则及酶切位点选择和设计 [整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法， 用 T 载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载 体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。但这就需要你仔细设计引物。连入质粒中的重 要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行 PCR 扩增出靶基因的时 候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱 说明书上找取相应的位点，进行设计。 （一）设计引物前应做的准备工作： 准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分 准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用 （二）设计引物所要考虑的问题 两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个 酶都切不好。因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位 点。我看 promega 的说明书上说，最好隔四个。还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比 如 AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。 两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。 最好使用酶切效率高的。 最好使用双酶切有共同 buffer 的酶。 最好使用较常用的酶（如 hind3，bamh1，ecor1 等），最好使用自己实验室有的酶，这样 可以省钱。 Tm 的计算，关于 Tm 的问题，很多的战友都有疑惑。其实园子里有很多的解释了。 Tm 叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是 DNA 双链溶解所需的温度。大家可以理 解，这个温度是由互补的 DNA 区域决定的，而不互补的区域对 DNA 的溶解是没有作用的。 因此，对于引物的 Tm，只有和模板互补的区域对 Tm 才有贡献。计算 Tm 时，只计算互补 的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。不少战友设计的引物都 Tm 过低，是因为他们 误把保护碱基和酶切位点都计算到 Tm 里了，最后的结果是导致了 PCR 反应的诸多困难。 所以，设计引物的时候，先不管 5端的修饰序列，把互补区的 Tm 控制在 55 度以上（我喜 欢控制在 58 以上，具体根据 PCR 的具体情况，对于困难的 PCR，需要适当提高 Tm），再加 上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。Tm 温度高的引物就比较容易克服 3‘发卡、二聚体及 3非特异结合等问题。简单的计算公式 可以用 2+4 的公式。若你计算的 Tm 值达到了快 90 ，不包括酶切位点。引物公司给你发 的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分 别为 29、33 个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为 17、21 个碱基。引物公司给的单 子是 70 多度，实际用的只有 50 度，用 55 度扩的结果也差不多。 其它关于 Tm 值的计算，有用 PP5.0 进行评价的，需要考虑的参数包括：base number、GC%、Tm、hairpin、dimer、false priming、cross dimer。退一般退火温度为 Tm-5 度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR 几个 循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度 比你 Tm 值低些（这样可能会增加非特异性），Tm 值是你包括酶切位点及保护碱基的 Primer 计算出来的。1.一般在 5端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入 T- VECTOR 或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基 2.有人的经验加入酶切位点的引 物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意。 关于引物二聚体，最好用 primer 或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的 △G（自由能）的绝对值，如果小于 10，一般是问题的。如果稍大，PCR 时可以提高一下 退火温度，一般是没有问题的。如果 3’端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果 PCR 没有条带，建议重新设计引物。 此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的△G。 在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为，一个特异性引物 一般都是 20bp 左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致就是 28bp 左右了。而我们 在设计退火温度时，与引物的长度有关，比正常的引物(20bp) 的 Tm 肯定要高一些。如果 我们能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。 还有，有些酶是离不开末端序列的，因此，在设计一个