2020(人教版)生物高考总复习课件 考点加强课5 基因表达载体构建中限制酶的选择原则.pptxVIP

限制酶选择的三大依据 1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类;(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst Ⅰ(目的基因两端均具Pst Ⅰ)。 (2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。 (2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。;2.根据质粒的特点确定限制酶的种类;(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 (2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。 (3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中KpnⅠ)。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 (4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而Nde Ⅰ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。;3.参照Ti质粒的T－DNA