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细胞爬片免疫荧光实验流程细胞爬片的制作固定的多聚甲醛细胞膜通透封闭山羊血清一抗孵育一抗浓度湿盒过夜漂洗二抗孵育二抗种属湿盒室温避光漂洗复染核避光漂洗封片荧光淬灭剂的封片液荧光显微镜下观察采集图像细胞的固定固定的定义将新鲜的活体组织或细胞立即加入固定液中以此使细胞保持原有形态结构的一种方法固定的意义组织和细胞的蛋白质凝固终止内源性或外源性酶反应原位保存抗原避免抗原失活或弥散停止细胞中的生化反应固定其中的各种生化物质状态防止细胞死亡后出现自溶分解使细胞中蛋白质脂肪糖酶等成分转变为不溶性物质以保持生前
* * 细胞爬片免疫荧光实验流程 1. 细胞爬片的制作; 2. 固定( 4% 的多聚甲醛); 3. 细胞膜通透( 0.5%Triton X-100 , 20min ); 4. 封闭( 6% 山羊血清, 30min ); 5. 一抗孵育(一抗浓度,湿盒,4℃过夜, PBS 漂洗); 6. 二抗孵育(二抗种属,湿盒,室温 1h ,避光, PBS 漂洗); 7. 复染核( DAPI ,避光, 5min , PBS 漂洗); 8. 封片(荧光淬灭剂的封片液); 9. 荧光显微镜下观察采集图像 。 * * 1. 细胞的固定 【固定的定义】 将新鲜的活体组织或细胞,立即加入固定液中,以此使细胞保持原有形态、结构的一种方法。 【固定的意义】 1 、组织和细胞的蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反应,原位保存抗原,避免抗原失活 或弥散。 2 、停止细胞中的生化反应,固定其中的各种生化物质状态,防止细胞死亡后出现自溶分解。 3 、使细胞中蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质,以保持生前形态。 4 、固定细胞形态,防止其变形或破裂。 5 、使组织内各种物质产生不同的折光率,便于观察和鉴定。 6 、使不同组织成分对染料有不同的亲和力,便于染色。 免疫荧光实验流程中一些注意事项 * 【固定液的选择】 * 2 、冰冻切片制备: 建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。 选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。 3 、血清封闭: 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致) 封闭,减弱背景着色。 封闭是血清与非特异性位点结合,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低 背景。 血清封闭的时间是可以调整的,一般 30min 。 * 4 、一抗孵育条件: 在免疫荧光实验中最重要,包括孵育时间和抗体浓度; 一抗孵育温度有几种: 4 度、室温、 37 度,其中 4 度效果最佳; 孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般 37 度 1-2h ,而 4 度过夜和从冰箱拿出后 37 度复温 45min ; 具体条件还要摸索。 * 6 、复染: 目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位; 一般常用 DAPI 复染。 7 、封片: 为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液; 避免产生气泡。 * 5 、二抗孵育条件: 二抗一般室温或 37 度 30min-1h ,具体时间需要摸索; 而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度; 切记要避光反应; 但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和 孵育时间; 最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留, 需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。 * 8 、切片清洗: 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间 和增多次数)尤为重要,一般在一抗的清洗是 5min*3 次; 注意( 1 )单独冲洗,防止交叉反应造成污染。 ( 2 )温柔冲洗,防止切片的脱落; ( 3 )冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。 ( 4 ) PBS 的 PH 和离子强度的使用和要求,建议 PH 在 7.4-7.6 浓度是 0.01M 。 (中性及弱硷性条件( PH7-8 )有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解; 低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解) * 9 、拍照: 封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度; 正确使用荧光显微镜,防止紫外线对眼睛的损害; 检查时间每次以 1~2h 为宜,超过 90min ,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减 弱;激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象;所以最多不得超过 2~3h ; 荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。后欲再启用 时,须待灯光充分冷却后才能点燃,一天中应避免数次点燃光源,关闭汞灯至少在 开启 15-30 分钟后; 时效性:标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯 塑料
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