AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK-21细胞中的表达.docxVIP

AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK-21细胞中的表达 摘要：本研究将构建好的双向反义表达载体 PQC- AS - P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞，收获假病毒，在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21 细胞，一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明，目的基因P12A在细胞中成功表达，且已经整合到细胞染色体基因组中，病毒抑制试验则表明重组反义质粒对FMDV的产生起到一定的抑制作用。 DV的产生起到一定的抑制作用。 关键词 AsiaⅠ型口蹄疫病毒 双效表达载体 BHK-21细胞转染 表达  口蹄疫（Foot and Mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth disease virus，FMDV）感染引起的猪、牛、羊等偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性的一种传染病[1]。目前，口蹄疫的防治主要还是依赖于有效的疫苗，但传统疫苗在安全性方面还存在一定的隐患，因此研制安全有效的新型口蹄疫疫苗成了口蹄疫工作者最为迫切的任务[2]。经过研究人员几十年的不懈努力，在口蹄疫基因疫苗的研究方面也取得了一些进展，但还是仅停留 DV各种抗血清均由本实验室提供，双效表达载体pQC-AS-P1+2A+3C由作者构建[3]，脂质体Lipofectamine2000购自invitrogen;聚凝胺(polybrene)为 Sigma 公司产品；E.Z.N.A.Endo-free Plasmid MiDi kit DNA提取试剂盒，购自OMEGA公司；JM109有本实验室提供。  1.2 方法  转染包装细胞Amp-293[4] 用中量质粒提取试剂盒提取阳性重组质粒，提取的重组质粒的浓度（OD260）应在0.1～1.0之间，转染质粒的纯度（OD260nm/OD280nm）一般要求在1.7～2.1之间。在转染前1d，用无抗生素的培养基培养Amp-293细胞，在每个培养皿中放入1～2个严格灭菌的飞片，待细胞融合度达到80%～90%时即可进行转染，转染时DNA与转染试剂LipofectamineTM 2000的配比应达到DNA(μg): LipofectamineTM 2000=1:2～1:3,按转染试剂LipofectamineTM 2000的说明操作。转染后，将细胞放到37℃,5% CO2的培养箱中培养。   2.2 RT-PCR检测RNA结果  　　用已构建好的重组质粒pQC-AS-P12A3C转染 BHK21后24h及48h收取细胞培养上清液，用RT-PCR检测细胞内RNA的转录情况。试验设计空白细胞对照。结果用P1与P2引物对分别扩出了目的带，而空白细胞却没有扩出，说明均在BHK-21细胞中得到了表达（见图2）。   　  　  　  　 //sixianghuibao/   基金项目：国家“973”前期专项（2004CCA00500）；国家高技术研究发展计划863项目（2006AA10A204）  作者简介：韩晓荣（1981-），女，甘肃定西人，硕士研究生，主要从事动物传染病学和病毒分子生物学研究，现在海南科技职业学院任教。  *通讯作者: 刘纪省,研究员，博士生导师.