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不同钾钠比的查氏培养基对大丽轮枝菌生物学性状及致病力的影响
不同钾钠比的查氏培养基对大丽轮枝菌生物学性状及致病力的影响 棉花的黄萎病为一种土传性病害,致病菌有大丽轮枝菌(Verticillium dahilae)和黑白轮枝菌(V. alboatrum)[1],早在20世纪90年代,张绪振等[2]研究发现,中国棉花黄萎病的致病菌主要为大丽轮枝菌。大丽轮枝菌的寄主范围广,目前已达到660多种,且该病原菌的变异程度高,产生的微菌核的抗逆性非常强,可在土壤中存活超过10年[2],是棉花上的一种主要病害[3,4],在中国的四大棉区都存在着较大的影响,目前尚未找到能够控制该病害发生的有效措施。 笔者在进行菌株的致病力测定时本文由收集整理,从华中农业大学张献龙实验室得到了一株纯合的对照菌株V991,培养性状为黑色菌核型,致病力强。经过多次继代培养后,角变得到一株白色的菌株,为菌丝型,气生菌丝茂盛,经查氏培养基接种后致病力明显弱于V991,但其性状可以得到稳定的遗传。经过rDNA-ITS分子鉴定发现弱毒株和强毒株的DNA序列完全相同,但生物学特性及致病力完全不同。 由于大丽轮枝菌的变异性非常强,在常规的PDA培养基上极易发生变异,经过多次继代培养后,菌株的致病力也会发生减退。PDA培养基作为一种半合成培养基,用于产孢或扩繁菌种较适合,但不适于研究培养条件对菌株的影响。查氏培养液作为组分已知的一种培养基,常用于黄萎病菌的扩大培养,继而对鉴别寄主进行根部接种。真菌的生长需要钾,在丛生真菌中,缺钾和钾过量对真菌的生长都不利[5]。而且胞内K+的大量积累对维持有机体的正常功能至关重要,K+的丢失会导致多种代谢途径如糖酵解和呼吸作用等受阻[6]。查氏液体培养基中钾、钠含量和钾钠比(K+/Na+)是已知的,因此本试验通过调整其中的K+/Na+,对培养基组分进行改进,用于培养菌株,观察并记录其生理生化特性以及菌株的致病性,阐明培养基中K+、Na+及其比值变化对目的菌株的影响,以及它们与菌株致病性的关系,为病原菌的致病机理提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试菌株 大丽轮枝菌菌株V991b(Vb),白色突变株V991w(Vw),由华中农业大学实验室提供;对照菌株Ay,由中国农业科学院棉花研究所提供。 1.2 不同培养基对大丽轮枝菌生物习性的影响 1.2.1 试验设置 试验设置以常规的查氏液体培养基为基础,钠盐和钾盐的用量及钾钠比见表1,其中无钠培养基CA6以等摩尔的硝酸钾代替硝酸钠;无钾培养基CA7以等摩尔的磷酸氢二钠代替磷酸氢二钾,以等摩尔的氯化钠代替氯化钾。其余成分均不变,分别为蔗糖30.00 g、硫酸镁0.50 g、硫酸亚铁0.02 g、琼脂15.00 g、去离子水1 000 mL。常规的查氏培养液的成分参见文献[6],为减少沉淀将磷酸盐分别灭菌,冷却后在无菌条件下加入到培养基中[7],其中K+/Na+为1.312∶1。 1.2.2 调查内容及方法 病原菌接种于PDA培养基上培养5 d,沿菌落外缘打孔,菌饼直径5 mm。再转接到不同K+/Na+ 的查氏固体培养基中,分别标记为CA1、CA2、CA3、CA4、CA5、CA6、CA7、CK,置于(25+1) ℃培养箱中黑暗静置培养,每隔1 d观察菌落生物学性状并用十字交叉法测量菌落直径。调查菌落质地、菌落形成特征、菌落颜色、色素有无、培养温度、培养基类型、测量时间和菌株生长速率,培养15 d后,结束调查。 1.3 不同培养基培养对大丽轮枝菌致病力影响的测定 1.3.1 接种病原菌的制备 参照1.2.1中的查氏培养基的成分,依次称重,将培养液100 mL装入250 mL三角瓶内,121 ℃、0.103 MPa条件下灭菌30 min。然后将在PDA平板中生长15 d的供试菌株用0.7 cm的打孔器打成菌碟,接入到查氏液体培养液中,在25 ℃黑暗条件下,120 r/min振荡培养15 d。 1.3.2 棉苗的致病力测定 种子经硫酸脱绒后,每个品种挑选饱满的棉种,播种前用70%的乙醇浸泡5 min,用5%的H2O2浸泡2 h,无菌水冲洗2~3遍。采用无土基质育苗技术育苗,将棉子播下[8]。保证苗床的湿度和温度,培养棉苗25 d至2~3片真叶时,即可接种。取每个品种60株棉苗,保持根部基本整齐一致,置于同一菌系的菌液中,使根充分接触菌液。裸苗浸根接种30 min,后移栽至营养钵中。在网室内放置最低最高温度表,记载每天的温度状况,均温26 ℃左右。观察和记录病害的发生情况,分别于15、20、25 d调查发病率及病情指数。 1.3.3 数据分析 采用DPS 5.0单因素方差分
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