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人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 染色体处于中期 Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo 人类染色体的制备 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 目的和要求: 了解人类外周血淋巴细胞的培养方法。 掌握染色体标本的制备方法。 材料: 培养人的外周血淋巴细胞。 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 实验原理： 在健康成年人外周血中，含有红细胞、白细胞和淋巴细胞。红细胞没有细胞核，无法得到染色体，只能通过淋巴细胞得到染色体。在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血凝素（PHA）的作用可转化成为淋巴母细胞，而重新进行有丝分裂活动。因此，当该类细胞在人体外经PHA刺激短期培养后，经秋水仙素处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 试剂: 植物血凝素 (PHA ) 刺激外周血淋巴细胞从G0期返回正常细胞周期。 秋水仙素（colchicine） 作用：阻止微管组装。 中期染色体无法排列赤道板。 抑制姐妹染色体的分离，将细胞停留在中期。 目的 : 获得大量的中期细胞。 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 其他试剂： 低渗液 (0.075 mol/L 氯化钾):能使细胞膨胀，便于染色体分散而易于观察和计数 固定液 (甲醇与冰醋酸按3: 1配制) :稳定染色体的形态结构，清除染色体外层物质对染色体在玻片上展开的影响，通过更换固定液2-3次，清除红细胞的碎片，使标本片的背景更为清晰，现用现配。 。Giemsa染液  人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 实验步骤： 1. 人类外周血淋巴细胞的培养 提取血液在含PHA、血清的培养基中培养 72小时。 大多数细胞进入第二细胞周期。 实验前4小时加入秋水仙素。 实验时，多数细胞停留在中期。 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 2.染色体标本制备 1）摇匀培养物，吸取培养物于离心管中。 2）2000r/m 离心 6min(注意配平), 吸弃上清液。 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 3）低渗: 加入预温37℃的 6ml KCl (0.075 M ), 吹打混匀沉淀, 37℃ 水浴 15min，以达到红细胞破裂、淋巴细胞膨胀和染色体分散的目的。 4）预固定：加入新配置固定液（甲醇：冰醋酸=3: 1配制 ）1ml，混匀, 2000r/m 离心6min, 吸弃上清。 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 5）固定 : 加入6ml固定液，混匀，室温放置10min。 6) 2000r/m 6min, 吸弃上清液。 7) 再固定: 重复5,6 步一次。 8) 加入0.5ml固定液, 非常小心混匀沉淀，制成细胞悬液。 9）将混合液从30cm左右高度滴2-3滴于冰湿的载玻片上。空气凉干。 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 3.染色 滴加数滴Giemsa, 染色 3-5 min.自来水冲洗,空气凉干。 1）摇匀培养物，吸取培养物于离心管中。 2）2000r/m 离心 6min, 倒去上清液。 3）低渗: 加入预温37℃的 6ml KCl (0.075 M ), 吹打混匀沉淀, 37℃ 水浴 15min. 4）预固定：加入新配置固定液1ml，混匀, 2000r/m 离心6min, 倒去上清。 5）固定 : 加入6ml固定液，混匀，室温放置10min。 6）2000r/m 6min, 倒去上清液。 7）再固定: 重复5,6 步一次。 8）加入0.5ml固定液, 非常小心混匀沉淀，制成细胞悬液。 9）将混合液从30cm左右高度滴2-3滴悬液于冰湿载玻片。空气凉干。 10）染色: 滴加数滴Giemsa, 染色 3-5 min.自来水冲洗, 空气凉干。 Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo Company Logo