酵母基因工程详解.pptxVIP

真菌基因工程一、真菌表达系统的优缺点二、酵母转化系统三、甲醇酵母表达系统四、丝状真菌表达系统一、真菌表达系统的优缺点具有原核系统的操作简便、分子生物学背景清楚的优点具有真核系统蛋白翻译后加工和分泌系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）缺点：产物糖基化位点和结构特点与高等真核的有差距二、酵母转化系统酵母宿主系统酵母载体系统酵母系统标记基因酵母转化方法外源DNA在酵母宿主中的命运1、酵母宿主系统用作模式真核生物的酵母宿主菌用作外源基因表达的酵母宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 用作模式真核生物的酵母宿主菌酿酒酵母（Saccharomyces cereviasiae）：*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物*繁殖方式与原核类似，易于操作*基因表达调控机理与高等真核类似用作外源基因表达的酵母宿主菌酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理 毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 汉逊酵母：多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis) 非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。能抑制超糖基化的突变类型 酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生突变类型生物效应型酿酒酵母对异源蛋白的mnn 甘露糖生物合成缺陷型糖基化反应很难控制，呈alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型超糖基化倾向，因此超糖och 外侧糖链添加缺陷型基化缺陷株非常重要。提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型突变类型生物效应作用位点ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平ose1 提高重组蛋白表达 转录水平ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Yrho- 提高重组蛋白表达 转录水平HOOC减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用靶蛋白Ubiquitin 76 aa Lysubiquitin ligase E3 靶蛋白Lysubiquitin ligase E3 靶蛋白Lys蛋白酶体减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌UBI 4缺陷型：在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能正常生长。UBA 1缺陷型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的Ubc4 - ubc5 双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效2、酵母载体系统野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母）人工构建质粒: 5种 酵母附加型质粒（YEp） 酵母复制型质粒（YRp） 酵母着丝粒质粒（YCp) 酵母人工染色体（YAC） 酵母整合型质粒（YIp）酿酒酵母中的2μ环状质粒野生型，双链、环状、6kb拷贝数达50至100个REP1FLPIRRAFAIRs 反向重复序列，600 bp，重组oriIRSTBFLP 编码产物驱动IRs的同源重组REP2REP 编码产物控制质粒的稳定性同源重组STB REP的结合位点接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及B克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质粒类似。人工构建酵母质粒的共同特点含有大肠杆菌质粒的复制元点，以便克隆操作含有一定数量供克隆操作的单一酶切位点含有在酵母和大肠杆菌