演示文稿关于质粒.ppt

质粒 质粒（Plasmid）：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子（covalently closed circular DNA）,也称为cccDNA,其大小通常在1~100KB范围内。 质粒的分类 质粒分为两类： 1.严紧型:当细胞染 色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒。 2.松弛型:当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。 质粒 质粒的形式： ①超螺旋DNA：在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存 在。 ②开环DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处 断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛 型的环状分子，称开环DNA。 ③线状DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则 形成线状DNA(LinearDNA）。 当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分 子的泳动速度快。 当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条 链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变 性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超 螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 质粒的提取 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤： 1.培养细菌使质粒扩增； 2.收集和裂解细胞； 3.分离和纯化质粒DNA。 采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁。 十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。 经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。 质粒 碱-SDS质粒小量制备 （1）培养物1.5ml，置于离心管内。 （2）10000g离心2min，弃上清。 （3）100ul预冷的solutionⅠ重悬，振荡2min。 （4）常温放置5min。（充分裂解释放DNA） （5）200ul solutionⅡ，上下颠倒5s。（不要太剧烈，振荡会损伤DNA） （6）水浴5min，12000g离心5min。 （7）加200ul冰上预冷的solutionⅢ，上下颠倒20s，混匀。 （8）水浴5min，12000g离心5min，将上清移至新的EP管内。 （9）加入5ul 2mg/mlRNaseA,37度放5min。 （10）加入（≤450ml）的酚-氯仿抽提。（见后） （11）乙醇浓缩。(见后) （12）70%乙醇沉淀，离心1min，吸去上清，挥发干酒精。 （13）25ulTE重悬沉淀，2-4ul电泳。 （14）-20℃保存。 Thanks